Страница: 14/26
ражали в виде Z аналогично определению активности компонентов
С2 и С4.
_Приготовление комплекса ЕАС14 .. 10 мл ЕА (концентрация 1 х
10 59 0 клеток/мл) инкубировали с 1,0 мл R2 при 37 5о 0 в течение 10
мин. Комплекс промывали VBS 52+ 0 до полного исчезновения фона (ли-
зированные эритроциты) с последующим центрифугированием при
1500g в течение 5 мин. Отмытый комплекс стандартизировали до
концентрации 1,5 х 10 58 0 клеток/мл как описано для ЕА. Комплекс
ЕАС14 использовали в работе в течение одного дня.
_Приготовление комплекса ЕАС1q с ограниченным числом эффек-
_тивных молекул С1q. . К 200 мкл суспензии ЕА (1,5 х 10 58 0 кле-
ток/мл) добавляли подобранное количество раствора С1q в общем
объеме 300 мкл. Инкубировали 30 мин при 37 5о 0С. Реакцию останав-
ливали охлаждением и добавлением 700 мкл охлажденного VBS 52+ 0.
Комплекс промывали 1 раз VBS 52+ 0/HSA и количество гемолитических
эффективных молекул С1q определяли с помощью реагента R1q.
_Получение комплекса ЕАС14 с ограниченным числом эффективных
_молекул С4b. . К 10 мл суспензии ЕА (1,5 х 10 58 0 клеток/мл) добав-
ляли 100 мкл реагента R2 и инкубировали 5 мин при 37 5о 0. Реакцию
останавливали охлаждением до 0 5о 0 в ледяной бане. Комплекс промы-
вали 3 раза VBS/HSA с центрифугированием и стандартизовали по
А 4412 0 при гемолизе. Количество гемолитических эффективных моле-
кул С4b определяли с помощью реагента R4.
_Приготовление стабилизированной мембраносвязанной С3-конвер-
_тазы ЕАС142 5oxy . 0. К 6 мл суспензии ЕАС14 (1,5 х 10 58 0 клеток/мл)
добавляли при 0 5о 0 180 мкл реагента R3 5oxy 0, 30 мкл 0,1 М NiCl 42 0 и
инкубировали 5 мин при 37 5о 0, реакцию останавливали охлаждением
до 0 5о 0 в ледяной бане. Добавляли 4 мл VBS, содержащего ЭДТА
(VBSE) и центрифугировали 5 мин при 1500g. Полученный комплекс
ЕАС142 5oxy 0 промывали 3 раза VBS 52+ 0 и стандартизовали при А 4412 0,
как описано выше.
_Определение гемолитической активности С3-конвертазы. . К 0,2
мл суспензии ЕАС142 5oxy 0 (1,5 х 10 58 0 клеток/мл) добавляли 0,1 мл
сыворотки, разведенной 1:9 VBS, содержащего 0,05 М ЭДТА (VBSE).
Общий объём доводили до 0,5 мл VBSE и инкубировали 30 мин при
37 5о 0. Реакцию останавливали добавлением 2,5 мл 0,15 М NaCl и
центрифугировали 5 мин при 1500 g. Степень гемолиза определяли
в супернатанте при А 4412 0.
_Выделение функционально активных субкомпонентов С1, первого
_компонента комплемента, на аффинном сорбенте. .
20 мл сыворотки крови человека наносили на колонку с
IgG-стеклом (9,5 х 2 см), уравновешенную 0,01 М трис-HCl-буфе-
ром с 0,15 М NaCl и 0,001 М СаСl 42 0, рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч
при 0 5о 0. После полного нанесения сыворотки протекание раствора
через колонку останавливали и колонку инкубировали с сывороткой
40 мин при 0 5о 0 для полного связывания комплекса С1. Колонку про-
мывали стартовым буфером со скоростью 20 мл/ч, собирая белковые
фракции (А 4280 0) и определяя в них остаточную активность С1q и
С1r 42 0s 42 0.
_Получение С1r 42 . 0. Колонку с IgG-стеклом с сорбированным С1
нагревали при 30 5о 0 в течение 40 мин для активации С1. Затем про-
водили элюирование при 0 5о 0стартовым буфером со скоростью 20
мл/ч, собирая фракции по 3 мл. В белковых фракциях определяли
активность С1r и С1s.
_Получение С1s. . После элюирования С1r стартовым буфером про-
водили элюирование С1s 0,05 М ЭДТА трис-НСl-буфере, содержащем
0,15 М NaCl, рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч при 0 5о 0. Фракции, об-
ладающие активностью С1s (около 60 мл) объединяли и концентри-
ровали ультрафильтрацией до 5,5 мл. С1s хранили при 4 5о 0 с 0,01%
NaN 43 0 в течение года.
_Получение С1q. . После элюирования С1s субкомпонент С1q элюи-
ровали с колонки с IgG-стеклом 0,02 М трис-НСl-буфером, содер-
жащим 1,0 М NaCl, 0,03 ЭДТА, рН 8,5 со скоростью 20 мл/ч при
0 5о 0. Фракции, содержащие активность С1q, объединяли и белок
осаждали сульфатом аммония при 33% насыщения. Для дальнейшей
очистки осадок С1q растворяли и фракционировали на колонке с
сефакрилом S-300, как описано в работе [48].
ОЦЕНКА ДРУГИХ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕКОЙ ЗАЩИТЫ
2Определение ферментативной активности
2мурамидазы (лизоцима)
Записать метод определения лизоцима (ферментативной актив-
ности мурамидазы).
В опытную пробирку наливают 0,4мл 0,15М солевого фосфатного
буфера с рН 6,2, добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки крови.
К полученной смеси приливают 2 мл стандартизированной (Е=0,66
на ФЭК в кювете N 5 при светофильтре N 6) бактериальной взвеси
суточной культуры микрококка в фосфатном буфере. Пробы помещают
в термостат на 30 минут при температуре 37 50 0С, затем замеряют
оптическую плотность на ФЭК в кювете N 2 с зеленым светофиль-
тром.
2Мониторинг за концентрацией фибронектина
Слежение за уровнем фибронектина в плазме позволяет прогно-
зировать направленность патологического процесса. При снижении
концентрации фибронектина до 100 мкг/мл (при норме 300 мкг/мл)
практически у всех детей развивались тяжелые токсические синд-
ромы. Для возмещения фибронектина в терапии токсических заболе-
ваний можно использовать криопреципитат (10-15 мл на инфузию).
Даже однократная введение оказывает положительный эффект у 65%
больных. /7062/
2Определение содержания серомукоида
(Mejbaum-Kkatzenellenbogen W.,1955)
К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 0,2 мл 0,95% водного
раствора NaCl и 0,9 мл 0,45М сульфосалициловой кислоты. В тече-
ние 30 минут смесь центрифугируют при 1500 об./мин. К 0,3 мл
надосадочной жидкости дабваляют 0,6 мл физраствора и 4 мл 0,1%
водного раствора танина, перемешвают и помещают на 30 минут в
кипящую водяную баню. Содержимое пробирки охлаждают и измеряют
оптическую плотность в кювете с длиной оптического пути 10 мм
на ФЭК при длине волны 590 нм против дистиллированной воды.
Содержание серомукоида в биологических жидкостях выражают в
единицах оптической плотности полученного раствора. В норме в
сыворотке крови содержание серомукоида составляет 0,11-0,13
единиц оптической плотности.
2Реакция кольцепреципитации
определения С-РБ
Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-
неч треть - исследуемой сывороткой. Капилляр покачивают 12-15
раз для смешивания ингредиантов и устанавливают вертикально на
пластилиновый штатив. оставляют 24 часа при комнатной темпера-
туре. Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии
СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности
деструктивных процессов в организме).
5Результат оценивают по высоте приципитата в капилляре.
2Определение концентрации фибриногена
Гравиметрический метод. К 1 мл плазмы крови добавляют 0,05
мл суспензии тромбопластина (10 мг/мл) для быстрого и полного
образования сгустка, 0,1 мл 5% раствора хлорида кальция, пере-
мешивают. Через 7-15 минут инкубации при 37 5о 0С образовавшийся
сгусток отжимали до полного удаления сыворотки и взвешивали на
торсионных весах. Полученную величину умножали на коэффициент
0,222. Концентрацию выражали в г/л.
ш1. 1999г. ЗАПОЛНЯТЬ ТОЛЬКО В ЛЕКЦИИ ПО НЕСПЕЦ. ФАКТОРАМ
Содержание БОФ
─────────────────────┬───────────────┬─────────────────────────
│ В норме │ При остром воспалении
─────────────────────┼───────────────┼─────────────────────────
│ │
СРБ (усл. ед.) │70 нг/мл,т.е. │ 0,1 г/л
│почти нет │
- у новорожденных │100 нг/мл с │
│постепенным │
│возрастанием │
│ │
Фибриноген │2-4 г/л │
│3-4 г/л │ 6-10 г/л
Гаптоглобин (Нр) │170-300мг/л │
│(70-150 мг%); │
│830-2700мг/л │
│0,1-0,04г% │
│0,6-1,8 г/л │ 3-6 г/л
Преальбумин │300 7+ 020 мкг/мл │
Орозомукоид (Оm) │550-1400 мг/л │
│= мкг/мл │
│0,6-0,9 г/л │ 1,5-3 г/л
Антитромбин-III │210-300 мг/л │
С3-компонент │550-1200 мг/л │
комплемента │1,3-1,7 г/л │ 2-3 г/л /2809к/
│100 мг% │
С1q-субкомпонент │100% │
комплемента │ │
Реферат опубликован: 7/04/2005 (67748 прочтено)