Биотехнология, биопрепараты

Страница: 19/26

- митогены микробного происхождения │

- ЛПС Г- бактерий │ - │ +

- туберкулин │ - /?/ │ + /2551к/98/

- митогены животного происхождения │

- анти-Ig │ - │ +

- смешанная культура │

лимфоцитов (СКЛ) │ - │ + (АПК на HLA)

- митогены растительного происхождения (лектины)

- ФГА │ +(для Тs) │ -

- Кон А │ +(для Тs) │ -

_- митоген лаконоса .│ _ + .│ _ +

5- джекалин 0│ 5 + 0│ 5 связывает Ig A

│ │ 5(используется для

│ │ 5выделения В-клеток

│ │ 5на колонке)

Связывание лектина │ │

Helix pomatia │ + │ -

│ │

Чувствительность │ │

к кортикостероидам │Высокая │Низкая (Л 496 0)

│ │

Функции 1.Участие в реакциях│1.АТ--образование

│ клеточного типа │2.Регуляция ИО

│ (Тк) │ (В-лимфоциты- АПК

2.Иммунорегуляторная│ = АГ-презентирую-

│ (Тх, Тs) │ щие клетки)

──────────────────────┴───────────────────┴────────────────────

3а. Д-лимфоциты - двойные лимфоциты, несущие на своей по-

верхности маркеры Т- и В-лимфоцитов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

(количественный аспект; без разделения)

5I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

5МЕТОДОМ МЕМБРАНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ /метод МИФ/

Анализ поверхностных маркеров субпопуляций лимфоцитов,

(хелперы, супрессоры, эффекторы).

1ЕКК (CD3- _CD56+ .),

В-клетки (СD19+)

Т-лимфоциты ( _ 2СD3+ . 0,CD56-) 1 - Образует комплекс с рецептором для АГ.

Тх - CD4+

Ts,Tk - CD8+.

Выделение лимфоцитов на фиколе --- мазок --- высушивание ---

фиксация --- обработка МАТ к определенному АГ --- обработка ан-

тисывороткой к МАТ (к Fc-фрагменту), меченых флюорохромом ---

микроскопия под люминисцентным микроскопом.

(Или в пробирке смешать суспензию лимфоцитов с МАТ --- мазок)

_Определение субпопуляции лимфоцитов с помощью МАТ

(моноклональных антител) методом непрямой поверхностной

иммунофлуоресценции

Для постановки этой реакции в центрифужную стеклянную пробир-

ку вносят 500 тысяч лимфоцитов, выделенных в градиенте фи-

колл-верографин. К 30 мкл суспензии клеток добавляют 20 мкл го-

тового коммерческого раствора МАТ, осторожно перемешивали и ин-

кубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. После

инкубации к лимфоцитам добавляли 1 мл раствора Хенкса, перемеши-

вали легким покачиванием пробирки и центрифугировали 2 - 3 мину-

ты при 1200 об./мин. Надосадочную жидкость осторожно сливали, а

оставшиеся капли среды убирали фильтровальными полосками.

В пробирку к отмытым клеткам вносят 20 мкл вторых (антимыши-

ных) антител, меченных ФИТЦ (FITC anti Mi), нежно перемешивают и

помещают в рефрижератор при 4 5о 0С на 30 минут. После реакции лим-

фоциты дважды отмывают раствором Хенкса и к осадку клеток добав-

ляют 50 мкл того же раствора, клетки ресуспендируют легким пока-

чиванием пробирки. Суспензию клеток переносят в лунки парафилма

на сухое предметное стекло, предварительно обработанное в 0,005%

растворе poly-L-lysine (Sigma), и инкубируют там в течение 20

мин при комнатной температуре. После адгезии клеток к стеклу ос-

торожно полосками фильтровальной бумаги убирали среду и вносили

по 20 мкл 50%-го раствора глицерина. При люминесцентной микрос-

копии использовали объектив микроскопа х90, окуляр х10. Оценку

реакции осуществляли по проценту светящихся клеток.

Характеристика моноклональных антител

в реакции непрямой поверхностной иммунофлуоресценции

──────────────┬ 5──────┬──────┬─────────────── 0┬──────────────────

Моноклональное│ 5Изотип│ Клон│ Молекулярная 0│ Специфичность

антитело │ 5 │ │ масса антигена 0│

──────────────┼ 5──────┼──────┼─────────────── 0┼───────────────────

DT-Anti-CD 3 │ 5IgG 2a│ICO 90│ 26,20,16 кДа 0│Зрелые Т-лимфоциты

│ 5 │ │ 0│

DT-Anti-CD 4 │ 5IgG 1 │ICO 86│ 56 кДа 0│Зрелые Т-хелперы/

│ 5 │ │ 0│ индукторы

│ 5 │ │ 0│

DT-Anti-CD 8 │ 5IgG 1 │ICO 31│ 32 кДа 0│Супрессорные/ цито-

│ 5 │ │ 0│токсические (киллер-

│ 5 │ │ 0│ные) лимфоциты

│ 5 │ │ 0│

DT-Anti-CD 16 │ 5IgG 1 │ICO116│ 50-65 кДа 0│NK-клетки, грануло-

│ 5 │ │ 0│лоциты, макрофаги

│ 5 │ │ 0│

DT-Anti-CD 22 │ 5IgG M │ICO 91│ 140 кДа 0│ В-лимфоциты

│ 5 │ │ 0│

──────────────┴ 5──────┴──────┴─────────────── 0┴─────────────────────

5II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА

5СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК

Подсчитать относительное количество Т- и В-лифоцитов в гото-

вых мазках. Сделать заключение о наличии иммунодефицита.

5ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК

В крови - 60-80% Е-РОК,

в лимфе - 95%,

в ЛУ - 65-70%,

в селезенке - 35-40%,

в тимусе - более 95%.

Данный тест - мера количества, а не функциональной активнос-

ти клеток. /6504/90-?/

CD2 - рецептор для эритроцитов барана. При смешивании сус-

пензии лимфоцитов с эритроцитами барана последние приливают к

ним, образуя т.н. "розетку". Процент розеток с эритроцитами ба-

рана /ЭБ/ по отношению к общему количеству лимфоцитов, оценива-

емое при проведении микроскопии, отражает относительное число

_Т-лимфоцитов (Т-РОК . = Т-розеткообразующая клетка).

- Теофиллин-резистентные Е-РОК (Тх) - 50-63%.

- Теофиллин-чувствительные Е-РОК (Тs) - 17-20%.

Количество Т-лимфоцитов (Е-РОК)

- в крови - 60 (80)%,

- в лимфе - 95%,

- в ЛУ - 65-70%,

- в селезенке - 35-40%,

- в тимусе - более 95%.

┌───┐ ┌───┐

CD2 4─ 0┤ 6 0Т 6 0├ 4─ 0CD2 FcR 4─ 0┤ 6 0В 6 0├ 4─ 0СR1

└───┘ └───┘

_Определение Т-лимфоцитов . осуществляли с помощью розеткообра-

зования с эритроцитами барана (Е-РОК). С этой целью лимфоциты

человека, взвешенные в среде 199, в концентрации 2 х 10 56 0 в 1 мл

предварительно инкубировали с исследуемыми образцами полипепти-

дов в различной конечной концентрации при температуре 37С в те-

чение 1 часа. После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добав-

ляли 0,1 мл 1% взвеси отмытых эритроцитов барана, центрифугиро-

вали в течение 5 минут при 1000 об/мин. После центрифугирования

осадок ресуспендировали и подсчитывали процент "активного" ро-

зеткообразования Т-лимфоцитов с эритроцитами барана. Для опре-

деления общего числа Т-лимфоцитов лимфоцитарно-эритроцитарную

взвесь оставляли при температуре 4 5о 0С в течение 2-х часов, после

чего подсчитывали в камере Горяева процент розеткообразующих

клеток.

- Теофиллин-резистентные Е-РОК (Тх) - 50-63%.

- Теофиллин-чувствительные Е-РОК (Тs) - 17-20%.

_Определение В-лимфоцитов . осуществляли с помощью розетко-

образования с эритроцитами барана, обработанными антителами и

комплементом. В этом случае также лимфоциты человека, взвешен-

ные в среде 199, в концентрации 2 х 10 56 0 в 1 мл предварительно

инкубировали с исследуемыми образцами полипептидов в различной

конечной концентрации при температуре 37 5о 0С в течение 1 часа.

Реферат опубликован: 7/04/2005 (67547 прочтено)