Страница: 20/26
После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляли 0,1 мл 1%
взвеси отмытых эритроцитов барана, обработанных антителами и
комплементом,центрифугировали в течение 5 минут при 1000
об/мин. После центрифугирования и повторной инкубации при тем-
пературе 37 5о 0С в течение 30 мин. осадок ресуспендировали и подс-
читывали процент розеткообразующих клеток.
Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах, Т-лимфоцитах (в перифе-
рической крови - 60-79% Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.
Т-лимфоциты практически все без исключения связываются с ЭБ,
и в меньшй степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки и
кролика. При 45 5о 0 происходит обратимая утрата рецепторов к ЭБ
Оптимальная температура - 4-18 5о 0С (При 37 5о 0 число розеток снижа-
ется до 20%). /6504/90-?/
_В-лимфоциты ., имеющие FcR и рецепторы к С3-компоненту компле-
мента (CR1), образуют розетки с эритроцитами барана, обработан-
ными антителами к ним и сывороткой мыши (как источника компле-
мента). Также подсчитывается процент РОК по отношению к 100
лимфоцитам ( _В-РОК .).
В крови В-лимфоцитов - 15% (10-25%).
5Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах, Т-лимфоцитах (в перифе-
5рической крови - 60-79% Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.
5Т-лимфоциты практически все без исключения связываются с ЭБ,
5и в меньшей степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки
5и кролика. При 45о происходит обратимая утрата рецепторов к ЭБ
5Оптимальная температура - 4-18оС (При 37о число розеток снижа-
5ется до 20%). /6504/90-?/ 0
5ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ
5СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ
Определение активности лимфоцитов - реакция БТЛ в ответ на
митоген лаконоса. (функциональный аспект)
Др. функциональные тесты (экспрессия рецепторов к определен-
ным регуляторам и пр.)
2Определение HLA (по В-лимфоцитам 0,
имеющим и I, и II класс антигенов HLA 2)
К суспензии лимфоцитов добавляют в 100 лунках по трафарету
МАТ к определенному HLA. В 6-12 лунках из 100 происходит обра-
зование ИК, которые выявляют последующим добавлением комплемен-
та (ксеногенной сыворотки). Под микроскопом определяют лунки с
разрушенными лимфоцитами. Если лимфоциты целы, то данного АГ у
человека нет.
5[Из фракции лимфоцитов выделяется В-субпопуляция на нейлоно-
5вой вате; срывается с нейлона. HLA определяется по В-лимфоци-
5там, т.к. на них имеется HLA и I, и II классов.] 0
4Из гепариновой крови человека выделяют лимфоциты (аналогично
4методике определения РОК), раскапывают по 1 мкл в примерно 100
4лунок планшетки. В каждую лунку добавляют МАТ (1 мкл) к соот-
4ветствующему АГ и 1 мкл кроличьего комплемента (цельную сыво-
4ротку). 1 час. 37о. Добавляют эозин, формалин. Планшетку ставят
4под микроскоп и определяют лунки с деструктированными лимфоци-
4тами, т.е. с АГ человека. Если в данную лунку добавлялись МАТ к
4А8 и у человека имеется HLA А8, то антитела связываются с лим-
4фоцитом, т.е. образуется ИК, который активирует систему компле-
4мента и МАК разрушает лимфоцит.
3ОЦЕНКА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА
- Подсчет относительного и абсолютного _количества . В-лимфоци-
тов.
- Развитие гуморального _иммунного ответа
-- после иммунизации АГ-ом.
- Определение функциональной _активности . В-клеток:
-- фенотип,
-- поликлональная активация - пролиферация мононуклеарных
клеток в культуре клеток на среде 199 (реакция бласт-
трансформации на митогены: ЛПС, на митогены в СКЛ),
-- антиген-специфическая стимуляция (иммунизация убитыми
вирусными вакцинами, гемоцианином или бактериофагом ФХ
174),
-- продукция иммуноглобулинов в культуре in vitro,
-- оценка _миграционной активности . (с помощью миграция-ин-
гибирующего фактора = МИФ).
- Определение медиаторов гуморального иммунного ответа в
крови и тканях ( _уровень ИЛ-1,2,6,4 .).
- Оценка функциональной _активности Т-регуляторов . (фенотип,
поликлональная активация митогенами, тесты Т-хелперной и
Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ).
- Определение поверхностных иммуноглобулинов различных клас-
сов на В-лимфоцитах (МИФ и др.).
- Общий уровень (нормальные, анамнестические АТ) иммуногло-
булинов ( _Ig М.G,A .);
4-- ракетный электрофорез (ЭФ)
4-- реакция преципитации (РП) по Манчини
4-- РПГА.
-- Уровень специфических АТ
--- определение титра АТ у больного к определенному инфи-
цирующему агенту (прямая и развернутая РА, РСК):
столбнячных, дифтерийных, стафилококковых, коклюшных,
дизентерийных и др. антител.
- Определение морфологиии лимфоцитов (должны быть шерохова-
тыми)
МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ /259,2551к/
────────────────────────────────────┬─────────────────────────
Методы │Чувствительность методов
│(выявляемое количество
│антител, г/мл)
────────────────────────────────────┴─────────────────────────
РА (реакция агглютинации) 10 5-6 0-10 5-7
- сальмонелл 10 5-6
- пневмококков 10 5-2
РГА (реакция прямой гемагглютинации) 10 5-4
РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) 10 5-7 0- 10 5-9
- Реакция Кумбса 10 5-7
Реакция коагглютинации (РКОА) 10 5-8 0-10 5-9
РП (реакция преципитации)
- в геле 10 5-2 0-10 5-3
- кольцепреципитация 10 5-3
- нефелометрия, турбидиметрия
- колориметрия (с реактивом Фолина)
- встречный иммуноэлектрофорез /ИЭФ/ 10 5-6 0-10 5-7
Реакция иммунофлюоресценции (ИФМ) 10 5-7
РЭМА 10 5-9 0и менее
РИМ 10 5-9 0и менее
Иммуноблоттинг (вестерн-блот) 10 5-7 0-10 5-9
РСК (реакция связывания комплемента) 10 5-6
Реакция иммунного лизиса 10 5-8 0-10 5-9
РН (реакция нейтрализации) 10 5-4 0-10 5-6
Реакции анафилаксии, кожная проба
нейтрализации токсина (in vivo)
──────────────────────────────────────────────────────────────
4Выявлена негативная корреляция между Ig M и альфа-2-макрог-
4лобулином (r=-0,85) и максимальная позитивная корреляция
4(r=0,87) между Ig M и , бета-2-гликопротеином и C3а-активатором
4и церулоплазмином. Максимальному уровню Ig G соответствовали и
4максимальные уровни других белков (комплемента, С1-инактивато-
4ра,альфа-1-антитрипсина, альфа-2-макроглобулина и пр.), что да-
4ло основание предположить наличие конституционных типов орга-
4низма по белково-синтетической функции.
2Способы получения антител
2I. Иммунизация (in vivo)
Иммунизация человека или животных с последующим получением
- цельной сыворотки
- гипериммунной сыворотки
- гамма-фракции (гамма-глобулинов)
Используют по жизненным показаниям.
Недостатки антисывороток:
Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и ни
концентрировали, содержит набор различных антител. Поэтому ее
называют поликлональной. Лишь небольшая часть антител направле-
на против специфичных антигенных детерминант, а остальные реа-
гируют с самыми разными антигенами. Этим объясняются многочис-
ленные "перекрестные" положительные реакции, которые приводят к
ошибочным диагнозам.
Еще один серьезный недостаток: для получения антител каждый
раз необходимо заново иммунизировать животных и очищать выде-
ленную сыворотку. Это стоит немалых денег.
3Этапы получения антисывороток
31. Иммунизация
Один объем антигена смешивают с 3 объемами полного адъюванта
Фрейнда и тщательно перемешивают. Полученную эмульсию вводят
внутрикожно по 0,1мл в 10 точек спины, расположенных по 5 в ряд
на расстоянии 2 см по обе стороны от позвоночника. Общая доза
иммуногена равна 10-100 мкг на кролика. Иммунизируют 6 кроликов
массой по 2 кг. Через 8-10 недель проводят пробное кровопуска-
ние. При удовлетворительном качестве антисыворотки последова-
тельно проводят до 3 кровопусканий, после чего кроликам дают от-
дохнуть в течение 1 месяца и затем делают следующие кровопуска-
ния. При неудовлетворительном качестве антисыворотки проводят
Реферат опубликован: 7/04/2005 (67736 прочтено)