Страница: 5/8
ELISA-МЕТОД=РЭМА
(Enzyme-linked immunosorbent assay =
реакция энзим-меченных атомов)
5Метод независимо разработали в начале 70-х годов шведские
5исследователи Энгвалл и Перлманн, голландские ван Веемен и Шуур
5и американские исследователи под руководством Рубинстайна.
К настоящему времени созданы многочисленные модификации ба-
зовой методики и наибольшее распространение получил гетероген-
ный ИФА на твердой фазе ( _твердофазный ИФА .). Коммерческие МАТ
(или АГ) фиксируют на лукнах пластиковых панелей, реже иммоби-
лизуют на бусах или нитроцеллюлозных мембранах. /2400к/
Лунка иммунологической планшеты с "пришитыми" антигенами
(диагностические планшеты)
│ │
│ │ >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)
│АГ>── 4Y 0 │ 4 Y
│ │* │ │ - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,
│ │ меченая пероксидазой хрена)
└────────────────┘ * - пероксидаза (ПХ) хрена
Н 42 0О 42 ───── 0Н 42 0О + [O]
5ПХ 0 радикал кислорода
+ раствор Н 42 0О 42 0 и красителя (хромогена),
изменяющего цвет в присутствии радикалов кислорода (орто-фе-
нилендиамин) --- спектрофотометрия (под вертикальным лучом)
После каждого этапа обработки планшета промывается физраст-
вором или буфером.
5ИФМ можно определить белки, содержащиеся в количестве нес-
5кольких нанограммов в 1 мл. В качестве ферментных меток исполь-
5зуют пероксидазу хрена, глюкозоксидазу, бета-галактозидазу или
5щелочную фосфатазу. 0
5Этапы:
5Первым этапом является связывание моноспецифических антител
5(или антигена, если искомым белком является антитело) на твер-
5дом субстрате, обычно на стенках пластиковой пробирки или план-
5шеты. Связывание происходит путем физической адсорбции белка на
5гидрофобной поверхности. 0
5- Полистироловая (полистереновых) планшетка обрабатывается
5антигеном для их сорбции (или антителами).
5- Добавляется альбумин (забиваются все свободные сайты свя-
5зывания, чтобы не было затем неспецифической сорбции антител). 0
5- Обработка антителами или сывороткой больного, содержащей
5предполагаемую разновидность антител.
5- Добавляется антисыворотка, меченная ПХ (пероксидазой хре-
5на).
5- Приливается реактив АВТS или др., который окрашивается
5после воздействия пероксидазы. Можно использовать смесь переки-
5си водорода и хромогена (ортофенилдиамина, изменяющего окраску
5в зависимости от количества радикальных форм кислорода от свет-
5ло-желтой до коричневой).
5- О наличии и количестве АТ судят по изменению цвета и ин-
5тенсивности окраски раствора. Измерение интенсивности окраски
5на спектрофотометре /СФ/. 0
5[ИФМ можно проводить двумя путями - по непрямому (описанному
5выше) и конкурентному типу. В первом случае конкурентные отно-
5шения отсутствуют: исследуемая биологическая жидкость реагирует
5с твердофазными антителами, после чего на удаляется из и в ре-
5акцию вводят меченые ферментом антитела, которые связываются
5уже иммобилизованным антигеном. В этом случае ферментативная
5активность прямо пропорциональна количеству антигена в исследу-
5емом материале. Во втором случае антиген, меченный ферментом,
5конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за выделенные на
5твердой фазе антитела, и ферментативная активность обратно про-
5порциональна количеству антигена в исследуемом образце.]
5В качестве твердой фазы используют вещества различного хими-
5ческого состава - полистирен, полипропилен, поливинил, гели
5декстрана, агарозы, полиакриламида, целлюлозы, нитроцеллюлозы,
5нейлон.
3РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД /АНАЛИЗ/ (РИМ=РИА)
РИСТ - радиоиммуносорбентный метод
Ставится аналогично ИФА, но с использованием антител, мече-
ных радиоактивным изотопом.
│ │
│ │ >── - АТ 41 0 (антитело первого порядка)
│АГ>── 4Y 0 │ 4 Y
│ │* │ │ - АТ 42 0 (молекула АТ второго порядка,
│ │ меченая изотопом)
└────────────────┘ * - радиоактивная метка --- счетчик
радиоактивности
Работа проводится в радиоизотопных лабораториях.
Используются антитела, меченные радиоактивным элементом -
иодом ( 5125 0I, 5131 0I) или др. - с последующим измерением радиоак-
тивности. Если предыдущие иммунохимические методы способны
улавливать концентрацию белка не ниже 1 мкг/мл, то с помощью
РИМ можно определить концентрации, измеряемые в пикограммах,
поэтому метод РИА считается одним из подходящих количественных
методов иммунохимического анализа.
Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию ради-
оактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специаль-
ных счетчиков бета- или гамма-излучения. Метод высокочувствите-
лен, но постепенно вытесняется иммунофлюоресцентным анализом.
/2551к/
3ИММУНОБЛОТТИНГ
и дот-микросвязывание
1Постановка методики:
│- Вертикальный электрофорез пробы в течение ночи
│- Снятие отпечатка на нитроцеллюлозную бумагу (полоски
│ или цельную)
│- Инкубация полосок бумаги в растворе антисыворотки к иско-
│ мому антигену. Промывка от несвязавшихся АТ.
│- Инкубация в растворе противовидовой антисыворотки (раст-
│ воре АТ второго порядка), меченых ПХ (пероксидазой хрена)
│- + раствор Н 42 0О 42 0 и красителя, изменяющего цвет в присутс-
твии радикалов кислорода. Присутствие АГ расценивается по
наличию окрашенных красителем пятен на бумаге.
5Метод основан на разделении полипептидов в ПААГ (полиакрила-
5мидном геле) и анализе разделения иммунохимическими методами
5после переноса разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану,
5на которой белки доступны для любого вида твердофазного иммуно-
5анализа (иммуноферментного или радиоиммунного).
5Этапы:
51. Электрофорез исследуемой смеси пептидов и маркеров с из-
5вестной молекулярной массой в ПААГ.
52. Окраска геля нитратом серебра.
53. Перенос следов белка на нитроцеллюлозную бумагу или мемб-
5рану на основе нейлона (отпечаток геля) с получением реплики
5электрофореграммы. Процесс переноса называется блоттингом, а
5полученный отпечаток - блотом или блотограммой. 0
54. Обработка бумаги в полиэтиленовом пакете в антисыворотке
5к исследуемым антигенам. Промывка.
55. Обработка антителами к фракции иммуноглобулинов, связан-
5ных с пероксидазой или с биотином (ИФМ).
56. Окраска авидин-пероксидазой или диаминбензидином с добав-
5лением перекиси водорода. Промывка. Высушивание. 0
.
3РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ /РН/
_ 21) РН вирусов в цветной пробе (в культуре ткани).
Допустим, у больного грипп типа В:
│ │ │ │ │ │
│ │ │РН │ │ │
├───┤ ├───┤ ├───┤
│ В │ │ В │ │ В │
└───┘ └───┘ └───┘
+ АТ к А + АТ к В + АТ к С
(+ антисыворотка - " - (+ антисыворотка
к вирусу типа А) │ к вирусу типа С)
│
Во второй пробирке
произойдет нейтра-
лизация вируса (РН).
Добавленные клетки
останутся живыми.
1Постановка методики:
│Вирусная культура
│+ антисыворотка к белкам адгезии вирусов (НА)
│ --- инактивация вируса (неспособность проникать в клетки
│ для репродукции)
│+ культура клеток --- гибели нет (метаболизм клеток продол-
│ жается, среда закисляется и окраска среды 199 меняется на
│ желтую.
При выявлении одного, допустим, из 3 типов вирусов гриппа
(А,В,С) в 3 пробирки добавляют исследуемую культуру вируса (ал-
лантоисную жидкость куриного эмбриона), затем в каждую пробирку
свою антисыворотку (против А, против В, против С) и после пре-
динкубации - культуру клеток в среде 199. В двух из трех проби-
рок АТ не свяжут вирусы, вирусы проникнут в клетки; клетки по-
гибнут, метаболизм прекратиться (среда перестанет желтеть и ос-
танется исходной - малиновой).
_ 22) РН вирусов в культуре ткани . 0 или курином эмбрионе по нейт-
рализации ЦПД.
Ставится аналогично, но наблюдается не изменение цвета пита-
тельной среды, а (чаще под микроскопом) отсутствие ЦПД (цитопа-
тогенного действия вируса) - образование многоклеточного синци-
тия, гигантских многоядерных клеток, появление включений, вези-
куляция клеток и пр.
_ 23) РН токсина антитоксической сывороткой
а) in vitro
- Реакция флоккуляции (хлопьеобразования)
Реферат опубликован: 15/06/2005 (23313 прочтено)