Культивирование вирусов

Страница: 5/6

Указанные ниже меры предосторожности носят самый общий характер и применимы только в тех случаях, когда вирусы не представляют какой-либо особой опасности. При использовании особо опасных вирусов, представляющих опасность для здоровья сотрудников лаборатории или людей и животных окружающего мира, сле­дует применять дополнительные меры предосторожности. К вирусам, представляющим особую опасность, относятся вирусы ньюкаслской болезни, вирусы ящура, вирусы везикулярного стоматита, вирусы оспы, вирусы бешенства, ви­русы герпеса типа В и так далее. Кроме того, нельзя быть уве­ренным, что даже такие вирусы, как SV40, не представляют опасности для человека.

Для заражения клеток и роста зараженных вирусами кле­ток должна использоваться специальная комната или груп­па комнат.

Никакие живые вирусы не должны выноситься из этих помещений, не будучи заключены в плотно закрывающиеся контейнеры. Следует принимать меры предосторожности, чтобы наружные поверхности этих контейнеров не были за­грязнены вирусными частицами.

При работе с вирусами должны быть использованы специ­альные защитные одежды (лабораторные халаты). После работы эта одежда должна помещаться в специальный бак для автоклавирования.

Все среды и стеклянная посуда, которые были в контакте с вирусами, должны быть обработаны хлоросом; только после этого их можно выносить из помещения, пред­назначенного для работы с вирусами.

Вся пластиковая посуда должна быть помещена в специ­альный бак для автоклавирования.

Оборудование для хранения и обработки вирусного мате­риала должно размещаться внутри помещения для работы с вирусами.

Лаборатория должна быть оснащена двухцикловыми авто­клавами, чтобы сотрудники лаборатории были защищены от вредоносных материалов.

ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСОВ.

Обнаружить присутствие вирусов и определить их количество можно с помощью целого ряда различных тестов, например:

1) Активность вируса измеряется путем определения количества содержащего вирус материала, необходимого для того, чтобы вы­звать специфическую реакцию в организме хозяина. Индуцируе­мая вирусом реакция может происходить по типу «все или ничего» (т. е. наличие или отсутствие инфекции), а может быть выражена количественно, например продолжительностью времени, необходи­мого для проявления инфекции, или числом поражений в слое чувствительных клеток. Количественное определение вирусной ак­тивности называется титрованием.

Наименьшее количество вируса, способное вызвать соответст­вующую реакцию, называется инфекционной единицей, и титр ис­ходной вирусной суспензии выражается числом инфекционных еди­ниц, приходящихся на единицу объема. Например, если минималь­ное количество суспензии вируса гриппа, вызывающее у мыши пневмонию при интраназальном введении суспензии ткани инфи­цированного легкого в разведении 1:106 равно 0,1 мл, то это значит, что титр вируса гриппа в исходной суспензии ткани лег­кого равен 107 инфекционным единицам на 1мл—1/(10~1-10-6) =107.

Как правило, обязательным компонентом метода титрования вируса является тест, позволяющий оценить результат инокуляции как положительный или отрицательный. Например, при титровании вирусов животных таким тестом может быть наличие или отсутствие видимых поражений в культуре клеток, воспалительная реакция на месте инокуляции вируса в кожу или роговицу, параличи, возникающие у животного в результате введения вируса в мозг, и т. д. Иногда размножение вируса можно выявить и в отсутствие видимой реакции со стороны организма-хозяина: на пример, заражение куриных эмбрионов миксовирусами можно обнаружить по появлению гемагглютининов в аллантоисной жидкости.

Наилучшие результаты дают методы титрования, в основе ко­торых лежит подсчет числа дискретных поражений на определенной площади слоя клеток, зараженных известным количеством содержащего вирус материала. В случаях когда число чувствительных к вирусу и доступных для него клеток можно практически считать бесконечно большим, как, например, при заражении фа­гом однослойной культуры бактерий на питательном агаре или при заражении вирусом сплошной однослойной культуры живот­ных клеток, поражения, вызываемые вирусом, или бляшки, образуемые фагом, в данном смысле подобны колониям бактерий на плотной питательной среде. Как число этих колоний пропорцио­нально числу бактериальных клеток, содержащихся в титруемом препарате, так и число бляшек прямо пропорционально количеству вируса, добавленному к однослойной культуре образование зараженными клетками вирусных частиц, которые могут быть идентифицирован, например, по природе нуклеиновых кислот и симметрии частиц.

2) Образование зараженными клетками нуклеиновых кислот, которые могут обладать характерной плотностью при цент­рифугировании в градиенте плотности или характерным размером при электрофорезе в агарозном геле или центри­фугировании в градиенте концентрации сахарозы.

3) Образование зараженными клетками или трансформирован­ными клетками характерных антигенов, которые могут быть визуализованы с помощью окрашивания флуоресцирующими специфическими антителами либо вызывать изменения в клеточной мембране, приводящие к адсорбции гема. В прямом методе антитела, полученные к вирусным антигенам, сочетаются с флуорохромом и используются для окраски за­раженных клеток. Положительная реакция (желто-зеленый цвет в люминесцентном микроскопе) указывает на присутствие в клетках вирусных антигенов. Этот метод, следовательно, мо­жет быть использован для выявления клеточной трансформа­ции, когда антитела вырабатываются, например, против ран­них антигенов вируса SV40, или для выявления образования зрелых вирусов, когда получаются антитела против капсидных белков. В непрямом методе антитела не сочетаются с флуорохро­мом. Вместо этого после взаимодействия антител с антигенами в фиксированных препаратах клеток к ним добавляются антигамма-глобулиновые антитела, конъюгированные с флуорохро­мом. Этот метод более чувствителен и позволяет избежать конъюгации каждого индивидуального антитела с флуоресцент­ным красителем. Так, одни и те же флуоресцентные антитела к антителам кролика (полученные у овец против кроличьих гамма-глобулинов) могут быть использованы для окраски лю­бых антител, образующихся у кроликов и взаимодействующих с вирусными антигенами в продуктивно зараженных или транс­формированных клетках. Еще более непрямой, но значительно более чувствительный метод, не требующий использования флуоресцентного микро­скопа - пероксидазный - антипероксидазный метод. Согласно этому методу, кроличьи антитела взаимодейст­вуют с антигенами фиксированных клеток и затем покрывают­ся антителами козы к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с комплексами пероксидазы хрена и кроличьей антипероксидазы. После этого препараты обрабатывают диамино-бензидином и перекисью водорода; коричневая окраска указы­вает на присутствие антигенов.

4) Наличие антигенов на вирусных частицах может приводить к реакциям гемагглютинации, позволяющим проводить ко­личественную оценку. У многих вирусов имеются антигены, которые могут адсорби­роваться на эритроцитах и вызывать их слипание. При взаимо­действии большого количества вирусных частиц и эритроцитов образуется сеть клеток, и суспензия агглютинирует, т.е. эрит­роциты выпадают в осадок. Существует некоторая специфич­ность, заключающаяся в том, что определенные вирусы вызы­вают агглютинацию эритроцитов определенных животных, но если обнаружена активная комбинация, то гемагглютинация становится быстрым тестом, позволяющим определить титр ви­руса. Кровь отбирают в гепаринизированный шприц и эритроциты промывают трехразовым переосаждением в 0,85%-ном NaCl при 200 g в течение 10 мин. Окончательный осадок эритроцитов суспендируют в 200-кратном объеме 0,85%-ного раствора NaCl. Удобнее всего проводить тест на гемагглютинацию в микротитровальных пластинках. В серию лунок микротитровальной пластинки вносят по 25 мкл 0,85%-ного NaCl или ФСБ; в первую лунку вносят 25 мкл суспензии вируса, и смесь перемешивают (разведение 1:2). 25 мкл переносят затем из первой лунки во вторую (раз­ведение 1:4) и так далее, до конечного разведения 1:2048. По­сле этого в каждую лунку добавляют по 25 мкл суспензии эритроцитов, смесь перемешивают и оставляют при 4°С, ком­натной температуре или 37 °С до наступления гемагглютинации (1-2 ч). В лунках, где произошла агглютинация, осадок эритроцитов имеет неправильную форму, а в лунках, где гемагглютинации не было, клеточный осадок образует компактную точку на дне лунки. Разведение в последней лунке, в которой происходила гемагглютинация, рассматривается как титр, и этому разведе­нию приписывается значение 1 гемагглютинирующей единицы (ГАЕ). Предшествующее разведение содержит соответственно 2 ГАЕ и так далее.

5) Образование зараженными клетками характерных фермен­тов, или ферментов, легко отличаемых по свойствам от соот­ветствующих ферментов клеток-хозяев.

4.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПИКОРНАВИРУСОВ НА ПРИМЕРЕ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИОВИРУСА ТИПА 3 В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК HeLa.

В качестве конкретной методики культивирования вирусов можно привести способ выращивания полиовируса в перевиваемых клетках.

Все процедуры проводятся в стерильных условиях.

Определенные сублинии клеток HeLa (например, HeLa S3) могут расти в средах с низкой концентрацией ионов кальция (например, CaS2MEM). Для эффективного заражения сущест­венно, чтобы клетки хорошо росли в виде однородной суспен­зии. Клетки осаждают низкоскоростным центрифугированием (15 мин при 900 g) и ресуспендируют в среде CaS2MEM до концентрации ~ 2.107 кл/мл (~1/20 исходного объема).

К клеточной суспензии добавляют вирус в концентрации 10—50 БОЕ на клетку; инкубируют ее на магнитной мешалке в течение 1 ч при 35 °С.

Реферат опубликован: 18/04/2005 (14809 прочтено)