Книга по генетике

Страница: 18/52

ном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин,

умственная ограниченность, как правило, не развивается или

имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скрини-

рующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.

Гидроксилирование фенилаланина является достаточно

сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3

фермента. Фенилаланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фер-

мент, состоящий из субъединиц с молекулярным весом 52 кД,

продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фе-

нилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению

фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфенилаланинемия может

возникать также при дефиците дигидроптеридинредуктазы и при

дефектах синтеза биоптерина. Однако, эти заболевания, хотя и

сопровождаются снижением активности РАН, значительно отлича-

ются от классической ФКУ и не коррегируются диетой, лишенной

фенилаланина.

PAH-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием

мРНК размером 2.4 кб. Наиболее распространенный тип мутаций

- однонуклеотдные замены (миссенс, нонсенс, мутации в сайтах

сплайсинга), причем часто эти мутации являются результатом

транзиций в 22-х обнаруженных в PAH-гене CpG динуклеотидах.

Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется не-

большой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный

характер внутригенной локализации мутаций (Scriver et

al.,1989). Так, наибольшее число миссенс мутаций встречается

в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок

связывания белка с кофактором, где располжено 5 CpG дупле-

тов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район лока-

лизации делеций - экзоны 1, 2 и 3.

Втури РАН-гена локализованоно более 10 полиморфных сай-

тов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим мар-

керам среди представителей разных рас и этнических групп

значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по

сцеплению между определенными мутациями в PAH-гене и гапло-

типами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5-и

наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоцииро-

вана только с одним из более, чем 70 гаплотипов по 8 рест-

рикционным полиморфизмам (Eisensmith et al., 1992). Мажорная

в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в до-

норном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 (DiLella

et al.,1986). В то же время другая мутация в экзоне 12 -

R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в част-

ности в Белоруссии и России, и не найденная в Японии и Ки-

тае, связана с гаплотипом 2 (DiLella et al.,1987). Мажорная в

Европе мутация R158Q в 40% сцеплена с гаплотипом 4, наиболее

частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Тур-

ции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к

9-и-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с "южными" гаплоти-

пами 6, 10 и 36.

Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморф-

ным сайтам рестрикции и мутаций в PAH-гене в разных популя-

циях, национальностях и этнических группах позволяет сделать

вывод , что большинство из них, или даже все, произошли уже

после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена

РАН в различных популяциях и этнических группах связано с

эффектом основателя. По некоторым оценкам эти мутации воз-

никли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет

тому назад. Однако, в ряде случаев распределение мутаций не

может быть обьяснено в генетических терминах, сопоставимых с

демографической историей. Несомненно доказанными являются

примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных

популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие попу-

ляционные частоты специфических мутаций в PAH-гене связаны,

по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с сущест-

вованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и

с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что

носительство РАН - мутаций повышает устойчивость организма к

токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторы-

ми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), раз-

вивающимися при хранении зерна и других продуктов

(Woolf,1986). Предполагается, что беременные женщины, гете-

розиготные пл РАН -мутациям имеют меньшую вероятность абор-

та, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно,

высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может

быть обьяснена мягким и влажным климатом этих стран,

способствующем росту таких грибов.

В медицинской практике используется как прямая, так и

косвенная диагностика мутаций в PAH-гене. Разработан очень

быстрый и эффективный метод ПЦР/StyI-диагностики cамой

частой в России (более 70%) мутации R408W (Ivaschenko,

Baranov, 1993; Иващенко и др., 1993). Дигностика других ма-

жорных мутаций в PAH-гене осуществляется методами ПЦР+АСО,

аллель-специфической амплификации (ARMS), методом одноните-

вого конформационного полиморфизма (SSCP) (см. Главу IY).

При первичном обследовании семьи черезвычайно удобно исполь-

зовать три полиморфные нейтральные мутации в кодонах 232,

245 и 385, сцепленные в Кавказских популяциях с определенны-

ми ПДРФ-гаплотипами, а значит и со специфическими мутантными

аллелями. Каждая из этих мутаций создает новый сайт рестрик-

ции и поэтому их аллельное состояние может быть легко проти-

пировано с помощью амплификации и рестрикции (Kalaydjieva et

al., 1991). При анализе семьи, в которой отсутствуют легко

идентифицируемые прямыми методами мутации, молекулярная ди-

агностика может быть проведена с помощью внутригенных поли-

морфных сайтов рестрикции. Удобен, в частности, Msp1-поли-

морфизм в 8-м экзоне, анализ которого может быть осуществлен

методом ПЦР/рестрикции (Wedmeyer et al., 1993). В последнее

время появились даные о наличии высокополиморфных сайтов

внутри интронов гена РАН, которые оказались особенно удобны-

ми для молекулярного маркирования мутантных аллелей (Goltzov

et al.1994).

Генокоррекция ФКУ успешно осуществлена в опытах in

vitro и в настоящее время находится на стадии эксперимен-

тальной разработки (Табл.9.2. Глава IX).

10.4.7 Синдром Леш-Нихана.

Синдром Леш-Нихана - рецессивное сцепленное с полом за-

болевание, обусловленное наследственной недостаточностью ги-

поксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и сопровож-

дающееся тяжелыми поражениями центральной нервной системы.

Фермент HPRT участвует в регуляции метаболизма пуринов,

контролируя превращение гуанина и инозина в соответствующие

рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессируется во всех типах кле-

ток с образованием мРНК размером 654 п.о.. Культивируемые

линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и

6-тиогуанину, и таким образом, могут быть отобраны на соот-

ветствующих селективных средах. Гетерозиготные носители му-

таций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию 2-х

типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в

первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных лу-

ковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество

мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя

и транскрибируется достаточно много мРНК, но в этих молеку-

лах обнаруживаются структурные и функциональные аномалии. В

небольшом проценте случаев у больных не удается выявить ни

белка, ни мРНК.

В 15% хромосом у больных с синдромом Леш Нихана ген

HPRT вовлечен в крупные структурные перестройки, корторые

могут быть выявлены методами Саузерн или Нозерн блот-гибри-

дизации. Синдром Леш Нихана одно из первых моногенных

наследственных заболеваний, для которых была проведена моле-

кулярная идентификация точечных мутантных аллелей. Именно на

этой моделе впервые был разработан и опробован метод анализа

мутаций, основанный на расщеплении РНК-ДНК гибридов рибонук-

леазой А в местах негомологичноно спаривания (метод расщеп-

ления рибонуклеазой А - см.Главу VI, Gibbs, Caskey, 1987).

Комбинация методов блот-гибридизации и расщепления рибонук-

леазой А позволяет выявить до 50% мутаций. В настоящее время

в гене HPRT найдено более 100 спорадических мутаций, полови-

на которых - однонуклеотидные замены типа миссенс, нонсенс и

в сайтах сплайсинга. Около 40% мутантных хромосом имеют

структурные аномалии, в том числе крупные делеции, нехватки

отдельных зкзонов и микроделеции одного или нескольких нук-

леотидов. В HPRT-гене, практически, отсутствуют мутации, до-

мининирующие по частоте в каких-либо популяциях. Исключение

составляет нонсенс мутация R170TER, которая составляет около

15% всех нуклеотидных замен (Gibbs et al., 1989). Также как

и при гемофилиях мутации гена HPRT чаще возникают в сперма-

тогенезе, чем в оогенезе. Вероятность мутирования возрастает

с возрастом отца. Идентифицировано 3 HPRT-псевдогена в хро-

мосомах 3, 5 и 11 (Stout, Caskey, 1984).

Описаны редкие случаи синдрома Леш Нихана у гетерози-

Реферат опубликован: 26/04/2005 (121934 прочтено)