Книга по генетике

Страница: 21/52

диссоциировать - разделяться, и ассоциировать - соединяться,

при изменении температуры или солевых концентраций. При каж-

дом цикле ассоциаци - диссоциации или, как еще говорят, от-

жиге - плавлении, будет точно воспроизводиться двухнитевая

структура - дуплекс, устойчивость которого определяется со-

ответствием нуклеотидных пар. Наиболее устойчивы структуры,

представленные полностью комплементарными нитями ДНК. Про-

цесс образования дуплексов носит название гибридизации. Спо-

собность к комплементарному спариванию оснований - одно из

самых замечательных свойств ДНК, определяющих возможность ее

саморепликации и точного выбора специфических участков акти-

вации молекулы в процессе считывания генетической информа-

ции. Это свойтво широко используется в молекулярной биологии

для поиска и идентификации нужных последовательностей в ог-

ромных молекулах ДНК при использовании в качестве зондов ее

сравнительно небольших меченых фрагментов.

У человека большая часть ДНК- 3.2 миллиарда пар основа-

ний, находится в ядрах клеток в виде 46 плотно упакованных,

суперскрученных за счет взаимодействий с ядерными белками

структур, называемых хромосомами. Сравнительно небольшая

часть ДНК - около 5%, пристствует в митохондриях - органел-

лах цитоплазмы, обеспечивающих процессы дыхания и энерегети-

ческого обмена клеток эукариот. В большинстве соматических

клеток ДНК представлена в двух копиях - по одной в каждой

хромосоме. Таким образом, в клетках присутствуют 23 пары

хромосом, 22 из которых гомологичны друг другу - аутосомы, и

одна пара (X и Y) - половые хромосомы. Наличие Y хромосомы

определяет мужской пол особи. При записи нормального карио-

типа индивидуума указывается общее число хромосом и тип по-

ловых хромосом. Таким образом, нормальный кариотип мужчины -

46,XY, а женщины -46,XX. В процессе гаметогенеза происходит

случайное расхождение гомологичных хромосом в мейозе и в

каждой зрелой половой клетке - гамете, остается только 23

хромосомы, то есть гаплоидный набор хромосом. При этом в

каждой гамете сохраняется лишь одна половая хромосома - го-

носома. В яйцеклетках это X хромосома, тогда как сперматозо-

иды с равной вероятностью несут как X, так и Y хромосому, то

есть пол будущей особи детерминируется геномом сперматозои-

да. При оплодотворении диплоидный набор хромосом восстанав-

ливается. В соответствии с современными представлениями ге-

ном человека состоит из 25 хромосом, 22 из которых аутосомы,

2 половые хромосомы и одна митохондриальная . В каждой клет-

ках присутствует порядка 1000 митохондрий, а в каждом мито-

хондрионе содержится около 10 кольцевых митохондриальных

хромосом, сходнах с хромосомами бактерий. Таким образом, в

клетках присутствует около 1000 копий митохондриальных хро-

мосом.

В хромосомах эукариот ДНК находится в двухнитевой форме,

что обеспечивает возможность ее точной репликации при каждом

цикле деления клетки. Одна нить кодирующая или смысловая,

комплементарная ей нить - антисмысловая. Декодирование ин-

формации, заключенной в молекуле ДНК, или процесс транскрип-

ции, осуществляется за счет избирательного синтеза молекул

РНК, комплементарных определенным участкам ДНК, так называе-

мых первичных РНК транскриптов. Транскрибируемые участки ДНК

носят название генов. Рибонуклеиновые кислоты (РНК) по своей

структуре очень сходны с молекулами ДНК. Они также состоят

из четырех нуклеотидов, только одно из пиримидиновых основа-

ний - тимин, заменено на урацил и в сахарозном остове вместо

дезоксирибозы представлена рибоза. Молекулы РНК существуют

только в однонитевой форме, но могут образовывать дуплексы с

молекулами ДНК. После синтеза молекулы РНК претерпевают

достаточно сложную модификацию - процессинг. При этом про-

исходят изменения в концевых участках молекул и вырезаются

области, гомологичные интронам - некодирующим частям гена.

Этот процесс называется сплайсингом. В результате из первич-

ных РНК транскриптов образуются молекулы информационной или

матричной РНК (мРНК), представляющие собой непрерывную

последовательность нуклеотидов, гомологичную только экзонам

- смысловым участкам гена. Молекулы мРНК в виде рибонуклео-

протеиновых гранул выходят из ядра в цитоплазму и соединяют-

ся с рибосомами, где происходит процесс трансляции - синтез

полипептидной цепи. Трансляция мРНК происходит в точном со-

ответствии с генетическим кодом, согласно которому последо-

вательность из трех нуклеотидов РНК - кодон, соответствует

определенной аминокислоте или сигналу терминации синтеза по-

липептидной цепи (Табл.1.1). Реализация генетического кода

осуществляется с участием 20-ти типов транспортных РНК

(тРНК), единственных нуклеиновых кислот, содержащих в своем

составе наряду с нуклеотидами одну из аминокислот. тРНК име-

ют кленовообразную форму, в хвостовой части молекулы распо-

ложена определенная аминокислота, в точном соответствии с

последовательности из трех нуклеотидов в области, называемой

антикодоном. Прохождение мРНК по рибосоме является сигналом

приближения к рибонуклеопротеидному комплексу той тРНК, у

которой последовательность нуклеотидов в антикодоне компле-

ментарна кодирующему триплету мРНК. Таким образом транспор-

тируется соответствующая аминокислота и осуществляется пос-

ледовательный синтез полипептидной цепи. Митохондрии имеют

свою автономную систему белкового синтеза: рибосомальные

РНК, мРНК и транспортные РНК.

Генетический код универсален для всех живых существ -

это одно из его главных свойств. Небольшие отличия в струк-

туре кода найдены только для митохондриальной ДНК. Так в ми-

тохондриальном генетическом коде стоп кодонами являются

триплеты АГА и АГЦ, кодирующие аргинин в ядерной ДНК

(Табл.1.1). Универсальность генетического кода служит наибо-

лее веским аргументом в пользу гипотезы об едином источнике

возникновения жизни на земле и о филогенетическом родстве

всех видов живых существ. Кроме того, именно это свойство

обеспечивает возможность прочтения в любых модельных клеточ-

ных системах искусственно введенной генетической информации,

сконструированной из фрагментов ДНК разного видового про-

исхожденеия. Таким образом, вся генная инженерия основана на

универсальности генетического кода. Другим свойством генети-

ческого кода является его вырожденность, заключающаяся в

том, что все аминокислоты кроме двух кодируются несколькими

вариантами триплетов. Действительно, из 64 возможных комби-

наций нуклеотидных триплетов РНК три соответствуют термини-

рующим кодонам - ochre, amber и opal, остальные варианты

(61) кодируют 20 аминокислот, причем триплеты, кодирующие

одну и ту же аминокислоту, как правило, различаются по

третьему нуклеотиду в кодоне. Таким образом, зная нуклеотид-

ную последовательность кодирующего участка ДНК, можно одноз-

начно прогнозировать аминокислотную последовательность соот-

ветствующего полипептидного фрагмента, тогда как одна и та

же аминокислотная последовательность может кодироваться раз-

личным образом. При этом, число возможных вариантов кодирую-

щих ДНК резко возрастает с увеличением длины полипептида.

На следующем этапе полипептидные цепи транспортируются

к специфическим органеллам клетки и модифицируются с образо-

ванием зрелого функционально активного белка. В некоторых

случаях информация с молекул РНК может обратно транскрибиро-

ваться в молекулы ДНК. В частности, при обратной транскрип-

ции мРНК образуются молекулы комплементарной ДНК - кДНК, в

которой в зависимости от полноты процесса представлены

частично или полностью все смысловые кодирующие последова-

тельности гена. Рассмотренная схема реализации однонаправ-

ленного потока информации ДНК-РНК-Белок составляет основу

центральной молекулярно-биологической догмы - рис.1.1.

Более детально с процессами репликации, транскрипции,

процессинга и трансляции можно ознакомиться в многочисленных

руководствах по молекулярной биологии, цитологии и генетике

(Стент, Кэлиндер, 1981; Зенгер, 1987; Льюин, 1987).

1.2 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция.

ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и кле-

ток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый

лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагмен-

тов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение

белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и

хлороформа, концентрирование молекул ДНК путем преципитации

в этаноле. Из 1 грамма сырой ткани или из 10!9 клеток обычно

получают 2 миллиграмма ДНК. У человека ДНК, чаще всего, вы-

деляют из лейкоцитов крови, для чего собирают от 5 до 20 мл

венозной крови в стерильную пробирку с раствором, пре-

пятствующим коагуляции (например, с глюгециром или гепари-

ном). Затем отделяют лейкоциты и разрушают клеточные и ядер-

ные мембраны добавлением буферных растворов, содержащих де-

натурирующие агенты. Наилучшие результаты при выделении ДНК

Реферат опубликован: 26/04/2005 (121944 прочтено)