Страница: 23/52
мость работы с чистыми препаратами ДНК, применение высокоме-
ченых радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость всей
процедуры делают её весьма дорогостоящей. Тем не менее, в
ряде случаев и сегодня метод не потерял своего значения в
том числе и для диагностики генных болезней. В последнее
время для этих целей нередко используют различные варианты
нерадиоактивного мечения или окраску ДНК азотно-кислым се-
ребром.
Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или
РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предвари-
тельной рестрикции и электрофореза носит название дот- или
слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на
фильтре, округлой или продолговатой, соответственно. На
рис.1.3 также изображены последовательные этапы этих мето-
дов. Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с
электрофоретически разделенными молекулами РНК носит назва-
ние Нозерн блот, тогда как Вестерн блот или иммуноблот - это
связывание электрофоретически разделенных белков, фиксиро-
ванных на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих ме-
тодов - дань уважения молекулярных генетиков профессору Сау-
зерну, внесшему неоценимый вклад в разработку эксперимен-
тальных подходов, используемых для анализа ДНК.
В ряде случаев для проведения гибридизации с ДНК зонда-
ми не требуется предварительного выделения и очистки ДНК.
Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на
фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромо-
сомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in
situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов исполь-
зуются препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называ-
ется FISH (flurescein in situ hybridization). Меченый
ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и
подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафаз-
ных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена
на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное значение
имеет также подбор условий, максимально способствующих про-
цедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК
и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании
радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обра-
ботки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК
зондов) места локализации последовательностей ДНК, компле-
ментарных использованному ДНК-зонду, можно непосредственно
наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответс-
твующими участками определенных хромосом (Рис.1.4).
Гибридизация in situ, является одним из наиболее эф-
фективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду
последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно
эффективна при исследовании распределения по геному повторя-
ющихся последовательностей ДНК, клонированных последователь-
ностей ДНК анонимного происхождения, при определении не
только хромосомной принадлежности, но и внутри-хромосомной
локализациии уникальных генов в тех случаях, когда имеются
соответствующие ДНК-зонды. При этом разрешающая способность
метода может достигать нескольких хромосомных бэндов. Сог-
ласно последним данным, в экспериментах на специально приго-
товленных и растянутых интерфазных хромосомах человека раз-
решающая способность метода FISH может достигать 50 kb, что
составляет всего около 1/20 величины среднего хромосомного
бэнда. Проблемы взаиморасположения клонированных фрагментов
ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса также с успе-
хом решаются методом FISH.
Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-овыми
зондами, проводимая на гистологических препаратах, является
одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифи-
ческого распределения и внутриклеточной локализации мРНК
(Манк, 1990). Подробно с этим и другими современными мето-
дом молекулярного и цитогенетического анализа, а также с их
многочисленными модификациями и вариантами можно ознако-
миться в серии работ, руководств и обзоров (Маниатис и др.,
1984; Дейвис, 1990; Sambrook et al., 1989).
1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.
ДНК-зондом может служить любая однонитевая ДНК огра-
ниченного размера, используемая для поиска комплементарных
последовательностей в молекуле большего размера или среди
пула разнообразных молекул ДНК. В ряде случаев в качестве
зондов используют искусственным образом синтезированные оли-
гонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых обычно
не превышает 30 нуклеотидов. Зондом также могут служить вы-
деленные из генома последовательности ДНК. Однако значитель-
но чаще такие последовательности предварительно клонируют,
чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неог-
раниченном количестве. Клонирование предполагает встраивание
(инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулу
ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бакте-
риальные клетки хозяина (Рис 1.5). Химерные молекулы ДНК,
составленные из фрагментов разного происхождения, носят наз-
вание рекомбинантных ДНК. В качестве клонирующих векторов
используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретро-
и аденовирусы, а также некоторые другие генетические конс-
трукции. Размеры клонированных ДНК-зондов составляют от со-
тен до нескольких тысяч нуклеотидов, что определяется, глав-
ным образом, способностью вектора удерживать чужеродный
фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов
плазмидную ДНК.
Плазмиды - это небольшие кольцевые двухцепочечные мо-
лекулы ДНК, которые могут присутствовать в различном числе
копий в бактериальных клетках. Открытие плазмид связано с
изучением генетической природы антибиотикоустойчивости. Ока-
залось, что именно плазмиды могут нести гены, сообщающие
клеткам устойчивость к различным антибиотикам, и потеря
чувствительности инфекционных бактерий к их действию как раз
и происходит за счет отбора тех штаммов, в которых имеются
плазмиды с соответствующей генетической информацией. Заме-
тим, что присутствие плазмиды в бактериальной клетке вовсе
не обязательно для обеспечения ее жизнедеятельности, так как
при отсутствии антибиотиков в среде обитания бактерий штам-
мы, не содержащие плазмид, вполне жизнеспособны. Плазмиды
имеют автономную систему контроля репликации, обеспечивающую
поддержание их количества в клетке на определенном уровне -
от одного до нескольких сотен плазмидных геномов на клетку.
Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным
контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клет-
ке в большом числе копий. Конструирование плазмидных клони-
рующих векторов заключается во внесении изменений в систему
контроля репликации и в добавлении или вырезании генов анти-
биотикоустойчивости или удобных для клонирования иных гене-
тических элементов: специфических сайтов рестрикции, инициа-
ции и регуляции транскрипции и т.п. Чаще всего для клониро-
вания используют плазмиды pBR322, ColE1 или их производные.
Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести
в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализа-
ции уникального сайта рестрикции. Присоединение (встраива-
ние, инсерция) фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной
молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов
-лигаз, после чего гибридная плазмида вновь принимает коль-
цевую форму. Разработаны достаточно простые и эффективные
методы трансформации бактерий, то есть искусственного введе-
ния плазмид в бактериальные клетки. При этом, присутствующие
в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в ка-
честве маркеров трансформированных бактерий для их отбора на
соответствующих селективных средах. При размножении
трансформированных бактерий происходит увеличение числа ко-
пий инсертированного фрагмента ДНК. Таким образом, этот чу-
жеродный для бактерий генетический материал может быть полу-
чен, практически, в любых количествах. Выделенная из бакте-
рий плазмидная ДНК или изолированный из плазмиды инсертиро-
ванный фрагмент могут быть в дальнейшем использованы в ка-
честве ДНК-зондов.
Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов
оказалось удобнее использовать фаги - бактериальные вирусы.
Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при
ее рестрикции образуются два фрагмента, которые сшивают с
чужеродной ДНК с образованием химерного фага. Чисто техни-
чески эта операция проще, чем инсерция в плазмиду. Однако,
размеры встраимовой ДНК ограничены пакующей способностью го-
ловки фага. Поэтому при конструировании вектора вырезают
последовательности фаговой ДНК, не имеющие критического зна-
чения для жизнеобеспечения фага. Такой бактериофаг может су-
ществовать только в том случае, если в него встроена чуже-
родная ДНК, по размерам сопоставимая с вырезанной фаговой
ДНК. Наиболее удачные конструкции векторов были получены на
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122487 прочтено)