Страница: 27/52
ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиоле-
те в виде красной полосы после электрофоретического концент-
рирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом.
Кроме того, возможна идентификация этих молекул путем блот
гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами.
При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках
ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза коли-
чество и положение окрашенных полос на геле изменяется в
соответствии с положением этих сайтов (Рис. 1.11 ). Путем
электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в
размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет
делеций или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной мат-
ричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых
молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также
структурные изменения в дуплексах между нормальными и му-
тантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И, на-
конец, возможно определение полной нуклеотидной последова-
тельности синтезированных молекул с идентификацией всех му-
таций в исследуемом районе матричной ДНК (см. Главу IV).
Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преиму-
щественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последуюшем зна-
чительно облегчает их секвенирование. В дальнейшем мы более
подробно рассмотрим методы генотипирования мутаций с помощью
ПЦР, позволяющие производить полный молекулярный анализ
определенных участков ДНК у отдельных индивидуумов. При этом
отпадает необходимость визуализации малых количеств ДНК пу-
тем их гибридизации с мечеными геномными или кДНК-зондами.
Это не означает, конечно, что методы блот гибридизации и
клонирования потеряли свою актуальность. Без их использова-
ния невозможна молекулярная идентификация генов, предшеству-
ющая разработке методов молекулярной диагностики с использо-
ванием ПЦР.
ГЛАВА VI.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.
Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор
адекватных биологических моделей.
Молекулярная идентификация гена, нарушение работы кото-
рого приводит к развитию наследственного заболевания, созда-
ет предпосылки для дальнейшего более подробного анализа ге-
нетических и биохимических основ патогенеза и разработки на
этой базе наиболее эффективных методов лечения. Начальные
этапы решения поставленной задачи включают в себя иссследо-
вание механизмов тканеспецифической экспрессии и регуляции
активности генов в нормальных клетках, оценку клинического
выражения различных типов нарушений гена, выявление первич-
ного биохимического дефекта, а также сопоставление молеку-
лярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.
Естественно, что в различных тканях организма
экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов.
Исключение составляют лишь так называемые гены домашнего хо-
зяйства (house-keeping genes), генопродукты которых обеспе-
чивают жизнедеятельность всех типов клеток (см.Главу II). По
весьма ориентировочным оценкам в тканях млекопитающих и че-
ловека работают в среднем около 2-3% всех генов, в клетках
печени - основной биохимической лаборатории организма - око-
ло 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9-10% (Корочкин,
1977). Это означает, что в различных соматических клетках
эукариот транскрибируется от 5 до 20 тысяч генов (Льюин,
1987). Значительная часть контролируемых ими белков необхо-
дима для обеспечения жизнедеятельности самих клеток. В про-
цессе онтогенеза и клеточной дифференцировки в разных тканях
организма происходит избирательная активация многих других
специфических генов, что, в конечном итоге, обусловливает
значительные межклеточные различия в наборе белков и в ско-
рости их синтеза.
Контроль генной активности осуществляется за счет диф-
ференциальной транскрипции и процессинга РНК в клеточных яд-
рах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной
трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным
результатом которой является синтез функционально активного
белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной
активности, но и полноценность всех последующих этапов,
включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность
к посттрансляционным модификациям, правильную локализации и
корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Ре-
шающее значение для успешного анализа всего этого сложного
комплекса имеет выбор адекватных биологических моделей, по-
иск и целенаправленное конструирование которых представляет
вполне самостоятельную научную задачу.
Наиболее доступными модельными системами для анализа
экспрессии генов in vitro являются культуры клеток. Для кло-
нирования, генноинженерного манипулирования, направленного
введения сайт специфических мутаций, получения большого ко-
личества клонированных последовательностей ДНК, специфи-
ческих молекул мРНК, а также белкового продукта гена обычно
используют генетически хорошо изученные прокариотические
системы (Хеймс, Хиггинс, 1987). Для исследования процессов
трансляции, посттрансляционных модификаций белка, его внут-
риклеточной локализации и функционирования чаще используют
культуры клеток эукариот и, в частности, специфические куль-
туры клеток человека. Особая роль в изучении начальных эта-
пов развития патологического процесса, обусловленного
присутствием генных мутаций, а также в разработке терапевти-
ческих методов, включая генноинженерную коррекцию метаболи-
ческого дефекта, принадлежит культурам мутантных клеток. Это
могут быть первичные или перевиваемые культуры клеток, полу-
ченные из специфических тканей больного человека, либо выде-
ленные из тканей линейных животных, служащих генетической
моделью наследственного заболевания.
Идентификация гомологичных генов у экспериментальных
животных во многих случаях значительно облегчает и ускоряют
исследование функциональной активности нормальных и мутант-
ных генов человека. Большая роль в изучении молекулярных ме-
ханизмов развития патологических процессов in vivo принадле-
жит генетическим линиям животных. Это могут быть линии, по-
лученные в результате отбора спонтанно возникших или индуци-
рованных мутаций, а также искусственно сконструированные мо-
дели на базе трансгенных животных, в геном которых введен
чужеродный ген или фрагмент ДНК. Рассмотрим основные экспе-
риментальные подходы, используемые для анализа экспрессии
генов.
Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция
и исследование мРНК, искусственные
транскрипционные системы.
Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК - белок
может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В
соответствии с этим исследования дифференциальной активности
генов в разных типах клеток и тканей включают оценку работы
контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех
этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и
изучение соответствующего белкового продукта, включая его
процессинг (созревание), внутриклеточную локализацию, тка-
неспецифическое распределение .
Исследования регуляторных цис-действующих элементов ге-
нома, таких как промоторы, инхансеры, участки ДНК, подавляю-
щие транскрипцию, являются составной частью анализа молеку-
лярной структуры любого гена. Идентификацию таких элементов
проводят с использованием разнообразных современных методов
молекулярной генетики. В частности, последовательности ДНК в
5'- фланкирующей области гена, ответственные за тканеспеци-
фическую индукцию генной активности, могут быть локализованы
путем исследования транскрипции в различных линиях клеток
при введении в них генов с искусственными делециями этих
участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регу-
ляторных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо
изученными неиндуцибельными клонированными генами, так назы-
ваемыми "репортерами". Такие генетические конструкции в
составе векторных последовательностей вводят в культивируе-
мые клетки эукариот и наблюдают за изменением уровня
экспрессии. В качестве "репортера" часто использую ген хло-
рамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT-ген), который в естест-
венных условиях экспрессируется только в клетках прокариот.
Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что позволя-
ет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в
клетке, но и с высокой точностью проводить количественную
оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии хи-
мерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек
африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки моди-
фицированы таким образом, что в них после трансфекции про-
исходит амплификация копий сконструированных определенным
образом эписом (внехромосомных генетических конструк-
ций ( см. Главу X), что ведет к значительному усилению сиг-
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122303 прочтено)