Страница: 29/52
уровнем экспрессии (до 1-2 грамм белка на литр культуры) и
их используют, обычно, для производства большого количества
чистого белка, необходимого для получения антител или для
фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введе-
ния изменений в различные районы полипептидной цепи путем
сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последователь-
ности чужеродной ДНК. Получение и исследование таких "му-
тантных" белков очень важно для оценки функциональной значи-
мости различных участков белка.
Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клет-
ках вдвое, а в клетках млекопитающих в десятки раз ниже, чем
в бактериальных. Однако, в бактериальных клетках отсутствуют
ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариоти-
ческих белков. Поэтому эукариотические системы удобнее
использовать для изучения посттрансляционных модификаций
белка - гликозилирования, то есть присоединения к полипеп-
тидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо-
ванием третичной структуры, часто, за счет возникновения
дисульфидных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирую-
щих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может
быть синтезировано достаточно много белка, чтобы получить
его в кристаллической форме и исследовать пространственную
структуру и функциональное назначение отдельных доменов
(Хэймс, Хиггинс, 1987).
Использование экспрессионных библиотек для изоляции ко-
дирующих последовательностей гена рассматривалось ранее (см.
Глава II). После секвенирования кДНК можно, исходя из гене-
тического кода, прогрозировать аминокислотный состав белка и
произвести компьюторный поиск в банке данных гомологичных
последовательностей в составе белков с уже известной струк-
турой и функциями. Выявление родственных белков, близких по
своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облег
чает дальнейший молекулярный анализ функционирования иссле-
дуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность
белка позволяет прогнозировать его третичную структуру,
идентифицировать домены, оценивать функциональную значимость
целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным
практическим следствием этих данных является также возмож-
ность получения антител к строго специфичным участкам бел-
ка. Для этого могут быть использованы два подхода - биохими-
ческий и молекулярно-генетический. В первом случае для имму-
низации используют искусственно синтезированные полипептиды,
которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену).
Размеры таких полипептидов, обычно, не превышают 30 амино-
кислот - они не могут быть очень большими из-за высокой сто-
имости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором
подходе экзонные участки гена инсертируют в экспрессионный
вектор в область, кодирующиую селектируемый белок. В резуль-
тате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в
котором наряду с аминокислотной последовательностью селекти-
руемого маркера содержится определенный фрагмент исследуемо-
го белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации
животных и получения моновалентных или моноклональных анти-
тел. При наличии антител могут быть применены различные им-
мунологические подхооды для анализа тканеспецифического и
внутриклеточного распределения белка, исследования его моди-
фикаций, а также для получения нативного белка в препаратив-
ных количествах.
Cледующим шагом на пути анализа молекулярных механизмов
регуляции экспрессии гена является идентификация тех наруше-
ний в структуре, локализации и активности молекул мРНК и
белка, которые возникают вследствие генетических мутаций. Мы
уже упоминали об огромном значении культур мутантных клеток
для подобных исследований. Однако, многие патологические
процессы, протекающие в организме больного, не могут быть
исследованы in vitro. С другой стороны, возможности получе-
ния необходимого количества клеток и тканей пациента и испы-
тания in vivo различных схем лечения значительно ограничены.
Поэтому для многих наследственных болезней эффективность
изучения основ патогенеза существенным образом зависит от
наличия адекватных биологических моделей. Способы конструи-
рования таких моделей подробно изложены в Главе YIII.
ГЛАВА II.
ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.
Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
тов.
Термин геном используется для обозначения полной гене-
тической системы клетки, определяющей характер онтогенети-
ческого развития организма и наследственную передачу в ряду
поколений всех его структурных и функциональных признаков.
Понятие генома может быть применено к таксономической груп-
пе, виду, отдельной особи, клетке, микроорганизму или ви-
русу. Так, можно говорить о структуре генома эукариот и про-
кариот, сравнивать геномы разных видов, изучать особенности
строения генома у конкретных индивидуумов или следить за из-
менениями, происходящими в геноме специфических клеток в
процессе их онтогенетической дифференцировки. Часто геном
определяется как генетическая информация, заключенная в мо-
лекулах ДНК одной клетки. Однако, такие факты, как
отсутствие связи между количеством ДНК в расчете на гаплоид-
ный геном и таксономическим статусом видов, а также много-
численные примеры существования огромных различий в содержа-
нии ДНК между близкородственными видами (так называемый
"С-парадокс") свидетельствуют о том, что далеко не все
участки ДНК связаны с информационными функциями. Понятия ге-
нома и ДНК в значительной степени тождественны, так как
основные принципы организации и функционирования генома це-
ликом определяются свойствами ДНК. Присущие этим молекулам
потенциальные возможности практически неограниченного струк-
турного разнообразия определяют все многообразие мира живых
существ, как на уровне межвидовых, так и индивидуальных раз-
личий в пределах одного вида (Баев и др.,1990; Ратнер,1985).
Процесс эволюции и дифференцировки отдельных видов, как
правило, сопровождался накоплением изменений в структуре ге-
нома. Это касается, прежде всего, таких параметров, как ло-
кализация и характер упаковки ДНК в клетках; количество ДНК,
приходящееся на гаплоидный геном; типы, соотношение и функ-
ции кодирующих и некодирующих нуклеотидных последователь-
ностей; регуляция экспрессии генов; межпопуляционная вариа-
бильность и филогенетический консерватизм первичной структу-
ры генома. В пределах одного вида основные параметры генома
достаточно постоянны, а внутривидовое разнообразие обеспечи-
вается за счет мутационной изменчивости, то есть выпадения,
вставки или замены нуклеотидов на сравнительно небольших
участках ДНК. Чаще всего такие изменения касаются не-
экспрессируемых элементов генома (интронов, псевдогенов,
межгенных спэйсерных участков ДНК и т.д.).
Геномы эукариот, по-существу, можно рассматривать как
мультигеномные симбиотческие конструкции, состоящие из обли-
гатных и факультативных элементов (Golubovsky, 1995). Основу
облигатных элементов составляют структурные локусы, коли-
чество и расположение которых в геноме достаточно постоянно.
Присутствие в хромосомах некоторых видов повторяющихся ДНК,
амплифицированных участков, ретровирусных последователь-
ностей, псевдогенов, также как наличие в клетке эписом, рет-
ротранскриптов, ампликонов, дополнительных B-хромосом и раз-
личных цитосимбионтов (вирусов, бактерий, простейших) явля-
ется не строго обязательным, их количество и положение может
значительно варьировать, то есть эти элементы являются фа-
культативными. В то же время участие факультативных элемен-
тов в наследственной передаче признаков, в формировании му-
тационной изменчивости и в эволюционных преобразованиях ви-
дов несомненно доказано. Кроме того, существует непрерывный
переход от одних состояний к другим за счет инсерции
экстрахромосомных ДНК в хромосомы и выстраивания транспозо-
ноподобных мобильных элементов из хромосом. Следовательно,
несмотря на значительные отличия факультативных последова-
тельностей от облигатных по характеру основных информацион-
ных процессов (репликации, транскрипции, трансляции и сегре-
гации), они также должны рассматриваться, как важнейшие эле-
менты генома.
Остановимся теперь более детально на основных принципах
организации генома человека. В каждой диплоидной клетке с 46
хромосомами содержится около 6 пикограмм ДНК, а общая длина
гаплоидного набора из 23 хромосом составляет 3.5 * 10!9 пар
нуклеотидов (Kao, 1985). Этого количества ДНК достаточно для
кодирования нескольких миллионов генов. Однако, по многим
независимым оценкам истиное число структурных генов нахо-
дится в пределах от 50 000 до 100 000. В разделе 2.4 изложе-
ны современные подходы, используемые для подсчета общего ко-
личества генов, из которых следует, что наиболее вероятная
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122341 прочтено)