Книга по генетике

Страница: 45/52

нальных зачатков и органов развивающегося зародыша. В ре-

зультате образуется животное - химера, состоящее из клеточ-

ных клонов двух разных типов: клеток исходного родительского

генотипа и ЭСК. Если эти клетки различаются, например, по

генам окраски шерсти, животное - химера будет иметь попереч-

ную или пятнистую окрашенность. При этом все животные, неза-

висимым образом полученные в результате введения в одинако-

вые по генотипу зародыши одной и той же линии клеток, будут

отличаться друг от друга по характеру пятнистости, так как

все химеры различны по набору клеточных клонов, развившихся

и дифференцировавшихся из введенных в зародыш ЭСК. Химерные

животные, у которых ЭСК дифференцировались в половые клетки

и дали начало полноценным зрелым гаметам будут устойчиво пе-

редавать своим потомкам генетическую информацию, содержащую-

ся в ЭСК. Таких животных ингда называют зародышевыми транс-

миттерами. При скрещивании их с мышами дикого типа часть по-

томков будет уже гетерозиготна по мутантным генам ЭСК, то

есть будут нести мутацию в гаплоидном состоянии в каждом ти-

пе клеток. Это в равной степени относится и к мутациям, ис-

кусственно введенным предварительно в ЭСК. Скрещивая таких

гетерозигот, можно получить животных, гомозиготных по задан-

ной мутации. Естественно, последнее достижимо только в том

случае, если мутация не окажется летальной в гомозиготном

состоянии у животных этого вида.

Возможность вести селекцию нужных мутантных или

трансгенных клонов ЭСК и лишь затем их использовать в ка-

честве клеточных векторов нашло широкое применение в генети-

ческом моделировании. Первоначально для этой цели ЭСК обра-

батывали различными мутагенами (этилнитрозомочевиной) отби-

рали клоны клеток, несущих мутацию в нужном гене, и затем

использовали их для создания инъекционных химер по Гарднеру.

Таким способом на мышах была получена модель болезни Леш-Ни-

хана - мутация гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы

(Hooper et al.,1987). C разработкой технологии адресной

доставки чужеродной ДНК в гены-мишени этот способ генети-

ческого моделирования стал особенно эффективным. Сайт-специ-

фическая модификация генов ЭСК достигается за счет гомоло-

гичной рекомбинации между экзогенной и хромосомной ДНК. При

трансфекции большая часть проникших в ядра молекул рекомби-

нантной ДНК сохраняется там в течение двух-трех дней в виде

кольцевых эписом и в дальнейшем теряется либо происходит ин-

теграция трансфецирующей плазмиды в геном клетки- хозяина

путем негомологичной рекомбинации, то есть в случайные сайты

хромосомной ДНК. В таких клетках экспрессия введенных генов

устойчиво сохраняется. Частота интеграции экзогенной ДНК мо-

жет быть повышена при использовании линейных плазмид и спе-

циальных, преимущественно, ретровирусных векторов экзогенной

ДНК (см. Главу IX). Случаи стабильной интеграции экзогенной

ДНК могут быть легко выявлены, если трансфецирующие плазмиды

или вектора содержат селектируемый маркерный ген. Чаще всего

в качестве маркера используют прокариотический ген neo, со-

общающий клеткам устойчивость к неомицину. Клетки, в которых

произошла интеграции такой плазмиды в хромосомную ДНК, будут

образовывать устойчивые клоны при выращивании на среде G418,

содержащей неомицин, в то время как все другие клоны клеток

будут в этих условиях деградировать.

Раздел 8.5. Методы направленного переноса генов.

Наиболее важным шагом на пути искусственного получения

мутантной линии животных является отбор клонов ЭСК с

сайт-специфической модификацией определенного гена. Однако,

случаи инсерции экзогенной ДНК в ген-мишень очень редки, их

общая частота, обычно, не превышает 10-6. Предпринимаются

попытки генетической модификации ЭСК с тем, чтобы повысить в

них частоту гомологичной рекомбинации. Идентифицированы не-

которые гены, контролирующие этот процесс у мышей и у чело-

века. Однако, в любом случае схемы направленной модификации

генов должны включать селекцию нужных клонов клеток. Впервые

направленная сайт-специфическая модификация была выполнена

также на гене гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (см.выше)

и была получена еще одна генетическая линия мышей, моделиру-

ющая вызванную дефектом в HPRT-гене болезнь Леш-Нихана у че-

ловека (Thomas, Capecci, 1987). Успех этих исследований, в

первую очередь, обусловлен существованием простых схем отбо-

ра клеток с функционирующим и нефункционирующим HPRT-геном

на селективных средах. Важно также, что этот ген локализован

в X-хромосоме и в ХУ-клетках он представлен одной копией.

При этих условиях случаи модификации гена, вызванные инсер-

цией экзогенной ДНК в правильном положении, легко идентифи-

цируются - Рис.8.1 (см. Главу X).

В настоящее время предложено несколько вариантов для

направленного переноса неселектируемых генов за счет допол-

нительной инсерции в трансфецирующую плазмиду селектируемого

маркерного гена в таком положении, при котором его экспрес-

сия происходит преимущественно при правильном встраивании

векторной последовательности в ген-мишень (рис.8.2). Так,

маркерный ген neo, помещенный в инсертируемую область ДНК

плазмиды без собственного промотора, может экспрессироваться

только находясь под контролем какого-либо другого промотора

хромосомной ДНК. Для этого инсерция экзогенной ДНК должна

произойти в область гена-мишени без сдвига рамки считывания.

При случайной интеграции экспрессии маркерного гена не будет

Таким образом, отбор неомицин-устойчивых клеток приведет к

резкому увеличению частоты клонов, в которых произошла гомо-

логичная рекомбинация между зкзогенной и геномной ДНК. На

этом же принципе основано использование генетических конс-

трукций с геном neo, не содержащим поли-А последовательности

в 3' области. Дальнейший поиск гомологичных рекомбинантов

среди G418-устойчивых клеток проводят путем блот-гибридиза-

ции, используя в качестве ДНК-зонда фрагмент векторной пос-

ледовательности, расположенный вне направленно переносимого

участка экзогенной ДНК.

Особенно перспективным на сегоднешний день представля-

ется метод позитивно-негативной селекции (Melton, 1994). Ме-

тод сочетает отбор клеток, в которых произошла интеграция

экзогенной ДНК, с селективной элиминацией тех из них, где

встраивание произошло за счет негомологичной рекомбинации.

Для этого маркерный селектируемый ген neo с регуляторными

последовательностями инсертируют в переносимую область ДНК

плазмиды, а вне этой области встраивают условно летальный

вирусный ген тимидинкиназы герпеса (HSV-tk). При интеграции

такого вектора в геномную ДНК путем гомологичной рекомбина-

ции HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тогда как при

негомологичной рекомбинации этот ген будет присутствовать в

неомицин-устойчивых клетках. Обработка таких клеток противо-

герписным агентом - ганцикловиром, будет сопровождаться ги-

белью всех клонов, экспрессирующих вирусную тимидинкиназу

(Рис.8.3).

Отбор клеток с модифицированным геном также может про-

изводиться с помощью ПЦР. При этом не используют какие-либо

маркерные гены и/или селектируемые среды. Олигопраймеры для

амплификации выбирают таким образом, что один из них гомоло-

гичен соседней с сайтом интеграции последовательности моди-

фицируемого гена, а другой соответствует участку инсертируе-

мой экзогенной ДНК (Рис.8.4). Метод позволяет обнаруживать

присутствие пяти правильно модифицированных клеток среди

50 000. После трансфекции клетки разделяются на группы, в

каждой из которых проводят тестирование с помощью ПЦР. При

положительном ответе группу клеток разбивают на подгруппы и

процедуру повторяют до тех пор, пока не удается изолировать

нужные клоны.

Направленное выключение генов-мишеней может быть достиг-

нуто несколькими способами. Так называемые, нулевые мутации

могут быть получены путем встраивания плазмиды, содержащей,

наряду с экзонными последовательностями модифицируемого гена

и селектируемым маркерным геном, сильные транскрипционные и

трансляционные стоп-сигналы. При этом в разрушенном за счет

инсерции экзоне транскрипция прекращается, в результате чего

образуется укороченный белок, незащищенный от действия кле-

точных протеаз.

Более совершенной является разработанная недавно техни-

ка двойной замены гена. Для этого используют ЭСК, дефицитные

по ферменту HPRT - НМ1 (Melton, 1994). На первом этапе

ген-мишень инактивируют путем замены одного из экзонов и

прилежащих последовательностей на HPRT мини-ген. При этом в

нокаутирующем векторе HPRT маркер фланкируется ДНК последо-

вательностями, гомологичными месту вставки в ДНК гена-мише-

ни. В этот же вектор включен и ген вирусной тимидинкиназы

(Рис.8.5). После трансфекции отбираются клетки позитивные по

HPRT и негативные по вирусной тимидин-киназе. Именно в таких

клетках с высокой степенью вероятности произошла гомологич-

Реферат опубликован: 26/04/2005 (121933 прочтено)