Страница: 51/52
Рассмотренные выше методы обнаружения мутаций предпола-
гают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК
с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки
их фенотипического проявления и определения причастности к
развитию болезни. Поэтому они редко используются в практи-
ческой диагностике и при популяционном скрининге гетерози-
гот. После описания мутации появляется возможность ее анали-
за более простыми способами, не требующими секвенирования.
Как упоминалось выше, мутации, изменяющие длину амплифициро-
ванных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного
электрофореза в полиакриламидном или агарозном гелях.
Из миссенс мутаций наиболее просто диагностируются те
замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или об-
разованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестриктаз.
Они выявляются по изменению длины амплифицированного фраг-
мента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой.
Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компь-
ютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализа-
ции замены основания. Вероятность такого события довольно
велика, так как для каждой из нескольких сотен известных в
настоящее время рестрикционных эндонуклеаз сайтом узнавания
служит своя специфическая последовательность ДНК, средние
размеры которой составляют 5 - 6 нуклеотидов.
Если естественных рестрикционных сайтов в месте мутации
найти не удается, то такие сайты могут быть созданы
искусственно. В частности, разработана методика создания с
помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но
не в аллелях дикого типа - метод ПЦР-опосредованного
сайт-направленного мутагенеза ( Ng et al., 1991; Eiken et
al.,1991). Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают
таким образом, чтобы 3'-конец одного из праймеров непосред-
ственно примыкал к мутантному сайту (Рис.4.8). Именно этот
праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем из-
меняют один из нуклеотидов с 3'-конца так, чтобы в сочетании
с нуклеотидом мутантного, но не нормального сайта в этом
месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из эн-
донуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов
амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих дан-
ную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один
нерестрицированный фрагмент, у гетерозигот появится два до-
полнительных фрагмента, соответствующих по длине рестрициро-
ванным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут
присутствовать только эти два фрагмента.
Концептуально близким к этому варианту является метод
получивший название "амплификация рефрактерной мутационной
системы"- amplification refractory mutation system - ARMS. В
основе метода лежит неспособность Taq1 термофильной полиме-
разы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия
(mismatch) между матричной ДНК и 3'-концом одного из олигоп-
раймеров (Newton et al.,1989; Bottema et al.,1990 ). Суть
метода заключается в оновременном проведении двух ПЦР, для
каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфи-
ческая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последова-
тельность, соответственно. При этом в качестве второго прай-
мера для проведения двух реакций выбирают одну и ту же оли-
гонуклеотидную последовательность, так что в обоих случаях
могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяжен-
ности.Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах распо-
ложен не в центре, а ближе к 3'-концу, и чаще всего занимает
предпоследнюю позицию. При определенных условиях, важнейшим
из которых является концентрация ионов магния в растворе,
наличие сайта негомологичного спаривания в 3'-области прай-
мера препятствует началу синтеза ДНК. Таким образом, при на-
личии мутации в исследуемой матричной ДНК амплифицированные
фрагменты образуются только в том случае, если в качестве
аллель-специфического праймера выбирается мутантная последо-
вательность, тогда как при использовании нормального олиго-
нуклеотидного праймера ПЦР блокируется (Рис.4.9.). Метод на-
шел широкое применение для детекции мутаций при фенилкетону-
рии, бета-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов
HLA системы. Однако, сложности в подборе праймеров и в выбо-
ре оптимального режима ПЦР ограничивают широкое применение
этого метода. Вместе с тем, его несомненным преимуществом
является возможность применения полностью автоматического
сканирования.
Таким же преимуществом обладают и методы детекции
состояния гена, основанные на лигировании синтетических оли-
гонуклеотидных зондов- OLA (oligonucleotide ligation assay).
При проведении этих реакций специфические ДНК или РНК после-
довательности исследуют путем использования их в качестве
матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотид-
ных зондов (Landegren,1993). ДНК-зонды для лигирования под-
бирают таким образом, чтобы они были полностью комплементар-
ны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации,
причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке
двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную
или флюоресцентную метку, а другой - метят биотином. После
гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные
олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК-лигазами из
термофильных микроорганизмов. Такие ферменты работают при
высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях,
необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При на-
личии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из
зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, не-
посредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие тер-
минального неспаренного основания в смежно расположенных
последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лиги-
рования и при определенных условиях проведения реакции сшив-
ки между зондами в этом случае не происходит. Метод включает
несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования
и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для
гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также
лигированные последовательности. В дальнейшем проводят
электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов
ДНК. Система успешно апробирована на мутациях глобиновых ге-
нов при серповидно-клеточной анемии и на мутации delF508 при
муковисцидозе.
Универсальным методом детекции замен оснований является
метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который
включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или
слот-гибридизацию с мечеными аллель-специфическими олигонук-
леотидами (Reiss, 1991). Для этого синтезируют два типа оли-
гонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 пар
оснований, в которых мутантный сайт занимает центральное по-
ложение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплемен-
тарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соот-
ветственно. Условия гибридизации подбирают таким образом,
чтобы дуплексы образовывались только при полной комплемен-
тарности гибридных пар. В этих условиях амплифицированные
фрагменты ДНК без мутации будут гибридизоваться только с
нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с му-
тантным и ДНК гетерозигот - с обоими олигонуклеотидами
(Рис.4.10). Для уменьшения перекрестной аллель-специфической
гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избы-
ток конкурентного немеченого олигонуклеотидного ДНК-зонда.
Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием
аллель-специфических ДНК-зондов, меченых биотином или пе-
роксидазой хрена (Лебедева и др.,1994).
Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом скани-
рования точечных мутаций является модифицированный вариант
ASO, так называемая гибридизационная система обратного
дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) (Saiki
et.al.,1989). Метод позволяет одновременно скринировать сра-
зу много точечных мутаций и доступен автоматизации
(Chebab, 1993). В этом случае проводят гибридизацию меченых
продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзоны,
с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфически-
ми олигонуклеотидными зондами (ASO). Предварительную иммоби-
лизацию мутантных и нормальных ASO-зондов на мембранах осу-
ществляют за счет присоединения гомополимерных T-хвостов с
дезоксирибонуклеотид-трансферазой на конце. При этом олиго-
нуклеотидные последовательности остаются свободными и могут
участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными
фрагментами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК ра-
диоавтографические или цветные пятна на фильтрах становятся
заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, пол-
ностью комплементарных тестируемой геномной ДНК. Реакцию,
обычно проводят в присутствии ионов тетра-алкиламмония,
уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122345 прочтено)