Страница: 52/52
оснований. Это позволяет использовать одинаковые условия
гибридизации для различных олигонуклеотидов, то есть вести
поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном
и том же экзоне гена. Данный метод положен в основу разра-
ботки специальных систем, предназначенных для одновременной
детекции наиболее распространенных мутаций в исследуемом ге-
не. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с
нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из которых соот-
ветствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со
смесью тех меченых амплифицированных экзонов, которые могут
содержать тестируемые мутантные аллели и создают условия для
аллель-специфифческой гибридизации. Таким способом сканируют
одновренно 42 мутации, ответственные за серповидноклеточную
анеми, 34 мутации при муковисцидозе (Сhebab,1993)
Очень простой метод обнаружения и идентификации
описанных ранее мутаций в амплифицированных фрагментах ДНК
основан на анализе характера электрофоретического разделения
продуктов ПЦР в MDE-гидросвязывающих гелях в присутствии
высоких концентраций мочевины. Эти гели способствуют форми-
рованию гетеродуплексов в процессе электрофореза, причем
расположение дуплексов очень специфично для различных му-
тантных аллелей, локализованных в одном и том же амплифици-
рованном фрагменте. Это позволяет не только выявлять, но с
высокой степенью вероятности идентифицировать известные му-
тации. В мультиплексном варианте методики возможен одновре-
менный поиск мутаций в нескольких амплифицированных фрагмен-
тах. Простота и высокая скорость анализа способствуют разра-
ботке на основе разделения в MDE-гелях схем максимальной ав-
томатизации процесса поиска и идентификации известных мута-
ций у пациентов и гетерозиготных носителей мутаций
Итак, методы выявления мутаций довольно разнообразны и
постоянно совершенствуются. В первую очередь, молекулярному
анализу подвергают те гены, повреждения которых сопровожда-
ются развитием наиболее частых заболеваний. Исследования
проводят либо в семьях высокого риска, где уже имеются боль-
ные с тем или иным моногенным заболеванием с целью выявления
гетерозиготных носителей, либо непосредственно в популяциях,
где имеется большая выборка больных и можно предполагать
высокую частоту гетерозиготных носителей мутаций. При этом
выбор конкретных схем идентификации мутантных аллелей, за-
частую, определяется диагностическими возможностями лабора-
торий и стоимостью анализов. Особое внимание уделяют поиску
тех аллелей, которые встречаются в популяциях с высокой
частотой. Именно для таких мутаций разрабатывают более
простые и эффективные методы молекулярной диагностики, поз-
воляющие тестировать больных и проводить скрининг гетерози-
гот среди их родственников или среди определенных групп
населения.
Важнейшей характеристикой мутантного аллеля является
его корреляция с тяжестью течения заболевания, то есть фе-
нотипическое выражение мутации в гомозиготном и в гетерози-
готном состоянии, а также в компаунде с другими мутантными
аллелями того же гена. Для многих моногенных болезней обна-
ружено большое число аллелей, которые по своему клиническо-
му проявлению могут быть подразделены на различные группы,
от очень мягких, оказывающих незначительный повреждающий
эффект, до летальных или полулетальных, обусловливающих
смерть пациентов в раннем возрасте. Таким образом, молеку-
лярная диагностика мутаций может иметь определяющее значе-
ние для прогнозирования развития заболевания и выбора адек-
ватной тактики лечения. Подобные скринирующие программы в
настоящее время разработаны и успешно осуществляются во
многих странах для таких распространенных заболеваний как
серповидноклеточная анемия, муковисцидоз (Rene et
al.,1994). Реализация этих программ наряду с большой меди-
цинской пользой приносит и массу социальных проблем, неко-
торые из которых будут рассмотрены ниже.
ВВЕДЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНУЮ ДИАГНОСТИКУ И ГЕНОТЕРАПИЮ
НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
В.Н.Горбунова, В.С.Баранов
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК.
Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене-
тический код.
Раздел 1.2 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция.
Раздел 1.3 Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация
in situ.
Раздел 1.4 ДНК-зонды, клонирование, векторные системы.
Раздел 1.5 Геномные и к-ДНК-овые библиотеки генов, их
скрининг.
Раздел 1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Раздел 1.7 Полимеразная цепная реакция.
ГЛАВА II. ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.
Раздел 2.1 Определение генома и его основных элементов.
Раздел 2.2 Повторяющиеся последовательности ДНК.
Раздел 2.3 Мультигенные семейства, псевдогены, онкоге-
ны.
Раздел 2.4 Современное определение понятия "ген",
транскрипция, регуляторные элементы генов.
Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
рикции, ПДРФ-анализ.
Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факультатив-
ные элементы генома.
Раздел 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные
сайты.
ГЛАВА III. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.
Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка
сцепления.
Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический
анализ, картирование анонимных последова-
тельностей ДНК.
Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.
Раздел 3.4 Хромосом-срецифические библиотеки генов,
пульсирующий гель-электрофорез.
Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки
по хромосоме, идентификация и изоляция ге-
нов.
Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.
Международная программа "Геном человека".
ГЛАВА IY. ТИПЫ И НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦИЙ. МЕТОДЫ ДНК-
ДИАГНОСТИКИ.
Раздел 4.1 Мутантные аллели, характеристика и типы му-
таций.
Раздел 4.2 Генетическая гетерогенность наследственных
заболеваний.
Раздел 4.3 Номенклатура мутаций.
Раздел 4.4 Идентификация структурных мутаций, изоляция
мутантных ДНК.
Раздел 4.5 Первичная идентификация точечных мутаций.
Раздел 4.6 Молекулярное сканирование известных мутаций.
ГЛАВА Y. ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ. ЭНДОГЕННЫЕ
МЕХАНИЗМЫ СПОНТАННОГО МУТАГЕНЕЗА.
Раздел 5.1 Популяционный анализ мутаций, полиморфизм,
неравновесность по сцеплению.
Раздел 5.2 Частоты спонтанного мутагенеза.
Раздел 5.3 Эндогенные механизмы возникновения мутаций.
Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му-
таций в популяциях.
ГЛАВА YI. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.
Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор
адекватных биологических моделей.
Раздел 6.2 Анализ регуляторных элементов гена, изоляция
и исследование мРНК, искусственные
транскрипционные системы.
Раздел 6.3 Анализ трансляции, ДНК-экспрессионные систе-
мы.
ГЛАВА VII. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ
ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.
Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг-
ностики.
Раздел 7.2 ДНК-диагностика при различных типах наследо-
вания.
Раздел 7.3 Группы риска, поиск гетерозиготных носите-
лей мутаций.
Раздел 7.4 Особенности применения молекулярных методов
в пренатальной диагностике моногенных болез-
ней.
Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, общая схема
пренатальной диагностики, точность прогнози-
рования.
ГЛАВА YIII. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
ЧЕЛОВЕКА.
Раздел 8.1 Генетические линии животных.
Раздел 8.2 Трансгенные животные.
Раздел 8.3 Экспериментальное моделирование.
Раздел 8.4 Конструирование модельных генетических ли-
ний животных.
Раздел 8.5 Методы направленного переноса генов.
ГЛАВА IX. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ.
Раздел 9.1 Определение, историческая справка, программы
генной терапии.
Раздел 9.2 Типы генотерапевтических вмешательств, выбор
клеток-мишеней.
Раздел 9.3 Методы генетической трансфекции в генной те-
рапии.
Раздел 9.4 Конструирование векторных систем и совер-
шенствование методов трансформации клеток че-
ловека.
9.4.1 Основные векторные системы.
9.4.2 Методы физического переноса чужеродной ДНК в
клетки эукариот.
9.4.3 Липосомный метод трансфекции.
9.4.4 Рекомбинантные вирусы.
9.4.5 Перспективы создания "идеальных" векторных
систем.
Раздел 9.5 Генотерапия моногенных наследственных заболе-
ваний.
Раздел 9.6 Генотерапия ненаследственных заболеваний:
опухоли, инфекции.
Раздел 9.7 Некоторые этические и социальные проблемы ген-
ной терапии.
ГЛАВА X. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ
МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
Раздел 10.1 Хромосомная локализация и принципы класси-
фикации генов наследственных болезней.
Раздел 10.2 Метаболические дефекты лизосомных фермен-
тов. Болезни накопления.
Раздел 10.3 Болезни экспансии, вызванные "динамически-
ми" мутациями.
Раздел 10.4 Моногенные наследственные болезни, диаг-
ностируемые молекулярными методами в России.
10.4.1 Муковисцидоз.
10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.
10.4.3 Гемофилия А.
10.4.4 Гемофилия B.
10.4.5 Болезнь Виллебранда.
10.4.6 Фенилкетонурия.
10.4.7 Синдром Леш-Нихана.
10.4.8 Болезнь Вильсона-Коновалова.
10.4.9 Адрено-генитальный синдром.
10.4.10 Спинальная мышечная атрофия.
10.4.11 Атаксия Фридрейха.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ГЛАВА Y.
ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ. МЕХАНИЗМЫ СПОНТАННОГО
МУТАГЕНЕЗА.
Раздел 5.1 Полиморфизм, неравновесность по сцеплению.
Молекулярная идентификация мутантных аллелей и разра-
ботка эффективных методов их диагностики у больных и у гете-
розиготных носителей являются той экспериментальной базой,
которая позволяет исследовать распространенность мутаций в
различных этнических группах и популяциях. Одновременно воз-
можен анализ сцепления мутантных аллелей с другими генети-
ческими маркерами и оценка на этой основе предполагаемых ме-
ханизмов возникновения и поддержания в популяциях наблюдае-
мого уровня изменчивости. Но прежде чем перейти к описанию
основных целей и методов популяционного анализа мутаций оп-
ределим более точно два основных понятия, часто используемых
при проведении подобных исследованиях - это понятия полимор-
физма и неравновесности по сцеплению.
Генетическая изменчивость локуса в определенной попу-
ляции измеряется уровнем полиморфизма, и количественным вы-
ражением этой меры служат частоты аллелей. В однолокусной
двухаллельной системе частоты двух вариантов аллелей - А1 и
А2, обозначаются буквами p и q, соответвственно, и (p+q=1).
Когда мы говорим, что в популяции существует полиморфизм по
мутации, это значит, что ее частота выше определенного выб-
ранного в соответствии с какими-то причинами условного уров-
ня, чаще всего выше 5%. Высокополиморфными считаются локусы
с близкими значениями частот аллелей. В больших популяциях
со случайным характером скрещивания, то есть в панмикти-
ческих популяциях, действует закон Харди-Вайнберга, согласно
которому частоты гомозиготных особей в популяции равны p!2 и
q!2, соответстенно, а доля гетерозигот равна 2pq. Таким об-
разом, в двухаллельной модели частота гетерозигот в популя-
ции по полиморфным локусам составляет от 10% и более, а по
высокополиморфным локусам может достигать 50%. Если число
аллелей в локусе больше двух, общая частота гетерозигот в
популяции равна 1 - (p1!2 + p2!2 + ... + pn!2), где pk -
частота аллеля Ak, k = 1, 2, ... n и p1 + p2 +... + pn = 1.
При этом доля гетерозигот в популяции возрастает с увеличе-
нием числа аллелей и достигает максимального предела в каж-
дой группе из n аллелей при равенстве их частот. Таким обра-
зом, при увеличении числа аллелей, встречающихся с равными
вероятностями, частота гетерозигот в популяции будет стре-
миться к единице, то есть подовляющее число особей в популя-
ции будут гетерозиготными по данному локусу. Такая ситуация
характерна для высокополиморфных микросателитных повторов, в
частности STR, что и делает их наряду с другими преимущест-
вами наиболее удобными генетическими маркерами.
Как мы уже упоминали, частыми моногенными наследствен-
ными заболеваниями считаются такие, при которых один больной
ребенок встречается среди 2000 - 10000 новорожденных, то
есть q!2 колеблется в пределах 1 /2000 - 1/10000. Соот-
ветственно, частота мутаций - q, в этих генах составляет от
0.5% до 2.5% и доля гетерозиготных носителей - 2pq, достига-
ет 1% - 5%. Для более редких заболеваний частоты гетерозигот
не превышают десятых долей процента. Тем ни менее, если
учесть, что общее количество различных моногенных заболева-
ний составляет около 5000 нозологий, оказывается, что, в
среднем, каждый человек является носителем мутантных аллелей
около десяти генов. В общем случае, набор этих генов разли-
чен у разных людей, и только в тех семьях, где оба родителя
являются носителями мутаций одного и того же гена появляется
25%-ый риск рождения больного ребенка.
До сих пор мы рассматривали изменчивость в одном локусе
- A. Понятие неравновесности по сцеплению определяет отноше-
ния между изменчивостью в двух локусах - A и B. Ситуация
здесь может быть двоякой. Если изменчивость в этих локусах
независима, то аллели двух локусов встречаются в популяции в
случайных комбинациях. Однако, если аллели различных локусов
в одних комбинациях встречаются чаще, чем в других, то гово-
рят, что существует неравновесность по сцеплению. Количест-
венно эта связь оценивается с помощью детерминанта неравно-
весности по сцеплению - d. Рассмотрим, чему равен детерми-
нант неравновесности по сцеплению в двухлокусной двухаллель-
ной системе. Пусть Pnm, где n=1,2 и m=1,2, частоты четырех
возможных в этом случае типов гамет - A1B1, A2B2, A1B2,
A2B1, а Pn и Rm - частоты аллелей локусов A и B, соот-
ветственно. Если сочетания аллелей в гаметах случайны, то
теоретически ожидаемые частоты гамет четырех типов равны
произведению частот входящих в эти гаметы аллелей, то есть
Pnm=Pn*Rm. В этом случае произведение частот двух типов га-
мет (A1B1 и A2B2), находящихся в состоянии "притяжения",
равно произведению частот гамет в состоянии "отталкивания"
(A1B2 и A2B1), то есть P11*P22 = P1*P2 *R1*R2 = P12*P21. Од-
нако, если сочетания аллелей в гаметах неслучайны, то эти
произведения различны. Их разность служит мерой неравно-
весности по сцеплению - d. Итак d = ¦P11*P22 - P12*P21¦ При
отсутствии неравновесности по сцеплению d = 0. Верхняя гра-
ница d = 0.25. Максимальная неравновесность по сцеплению
достигается при полном отсутствии двух типов гамет, находя-
щихся либо в состоянии "притяжения", либо в состоянии "от-
талкивания", при одновременном равенстве частот оставшихся
двух типов гамет.
Мутации в различных локусах возникают, как правило, не-
зависимо друг от друга и наличие неравновесности по сцепле-
нию, по-видимому, отражает тот факт, что мутация в одном из
локусов возникла в хромосоме, несущей определенный аллель
другого локуса, и далее эта хромосома получила распростране-
ние в популяции. Неравновесность по сцеплению является очень
важной популяционной характеристикой, позволяющей судить о
порядке и примерном времени возникновения различных мутаций,
а также оценивать возможные механизмы их поддержания в попу-
ляции. Обнаружение сильной неравновесности по сцеплению меж-
ду специфическими мутациями гена и определенными аллелями
маркерных локусов имеет важное практическое значение. Часто
наблюдается неравновесность по сцеплению между мутантными
аллелями гена и одновременно несколькими маркерными локуса-
ми. В этом случае анализ маркерных гаплотипов, то есть набо-
ров аллелей различных локусов, локализованных в одной хро-
мосоме, дает возможность с высокой степенью вероятности оце-
нивать характер мутационного повреждения и прослеживать его
наследование в семьях больного.
Раздел 5.3 Частоты спонтанного мутагенеза.
Считается, что средняя частота спонтанного возникнове-
ния мутаций в структурных локусах человека колеблется в пре-
делах от 10(-5) до 10(-6) на одну гамету за каждое поколе-
ние. Однако, эта величина может значительно варьировать для
разных генов, меняясь в пределах от 10(-4) для высокомута-
бильных локусов до 10 (-11) в наиболее устойчивых частях ге-
нома. Эти различия зависят от многих факторов и, в первую
очередь, от характера мутационного повреждения, от механизма
возникновения мутации и локализации нарушения. Большое зна-
чение также имеет сам ген, протяженность его кодирующих об-
ластей и те функции, которые выполняют контролируемые им мо-
лекулы в обеспечении жизнедеятельности клеток и всего орга-
низиа, в целом. Так например, нарушение работы генов, про-
дукция которых необходима на ранних стадиях эмбриогенеза,
может приводить к гибели плода. Такие мутации трудны для ди-
агностики и в практической медицине мы чаще всего имеем дело
только с теми мутациями, которые не проявляют летального эф-
фекта на ранних стадиях эмбрионального развития. Тем ни ме-
нее, не исключено, что ранние эмбриональные летали составля-
ет немалый процент среди мутантных аллелей различных генов и
вносят определенный вклад в снижение репродуктивной функции.
Особого внимания заслуживает проблема мутирования в
STR-сайтах и в VNTR- локусах, часто используемых в настоящее
время для геномной дактилоскопии и молекулярной диагностики.
Эти участки генома, изменчивость в которых обусловлена раз-
личиями в числе тандемных повторов, формально можно отнести
к разряду высокомутабильных. Заметим сразу, однако, что пря-
мое сопоставление темпов мутирования в кодирующих областях
генома и в мини- и микросателлитных последовательностях ДНК,
по-видимому, некорректно, так как физическая основа изменчи-
вости, наблюдаемой в этих функционально и структурно разли-
чающихся локусах совершенно различна. Мутабильность в
STR-сайтах обусловлена нестабильностью числа повторов, при-
чем возникающие мутации затрагивают, как правило, лишь весь-
ма ограниченное число кластерированных копий, чаще всего 1
или 2. Подобные тандемные повторы редко наблюдаются в
смысловых последовательностях ДНК. Исключение составляют
лишь мутации экспансии, но и для них характерно (1) сущест-
вование большого числа аллелей дикого типа, отличающихся
друг от друга небольшим числом копий, и (2) значительные
различия по длине повторяющегося участка между нормальными и
мутантными вариантами гена. Кроме того, изменчивость в
STR-сайтах в основе своей носит нейтральный характер и пото-
му темп мутирования в этих локусах не подвержен жесткому
контролю со стороны естественного отбора.
Прямые исследования показали, что в большинстве случаев
частота возникновения спонтанных мутаций в микросателлитных
STR -сайтах варьирует в пределах от 0.1% до 0.45% на гамету,
что должно учитываться при использовании этих маркеров в
практической медицине. Частота мутирования в вариабильных
(C-A)n -повторах, используемых в качестве индексных маркеров
в Genethon - картах сцепления составляет 0.05% на гамету.
Показано, что для ряда VNTR-локусов (MSB2) частота мутирова-
ния достигает 0.7% на гамету. Для других локусов (М17) обна-
ружено достоверное превышение скорости мутагенеза в зароды-
шевых клетках по сравнению с соматическими. Для многих
достаточно стабильных STR-локусов обнаружены существенные
межпопуляционные различия по частоте аллелей, что позволяет
использовать эту изменчивость для генетической характеристи-
ки отдельных популяций. В то же время другие STR-сайты зна-
чительно чаще подвергаются спонтанному мутированию, что при-
водит к уравновешиванию паттерна аллелей и делает эти марке-
ры малопригодными для популяционных исследований. Имеются
данные, что в наиболее вариабильных STR-локусах частота
спонтанных мутаций может достигать 5% на гамету за поколение
(Jeffreys et al., 1988).
Раздел 5.3. Эндогенные механизмы возникновения мутаций.
Основную часть мутаций, ведущих к наследственным болез-
ням, составляют точечные мутации, делеции и в меньшей степе-
ни инсерции и дупликации. При этом, как показывает детальный
сравнительный анализ, частота, тип и локализация этих мута-
ций отнюдь неслучайны и зависят от многих, пока еще невы-
ясненных эндогенных механизмов мутагенеза. В пользу такого
вывода свидетельствует уникальный характер спектра мутаций
для каждого из многих десятков генов, первичная структура
ДНК и типы мутаций которых уже хорошо изучены. Так, для мно-
гих структурных генов доминирующими по спектру и частоте яв-
ляются точечные мутации (ген трансмембранного регуляторного
белка муковисцидоза, ген фенилаланингидроксилазы, ген факто-
ра IX cвертывания крови, бета-глобиновый ген и мн др.), тог-
да как для других - достаточно протяженные структурные пе-
рестройки типа делеций, дупликаций и инсерций (гены дистро-
фина, фактора VIII свертывания крови, 21-гидроксилазы)
(см.Главу X). К структурным факторам, определяющим эндоген-
ные механизмы мутагенеза, можно отнести (1) наличие прямых и
обратных повторов и симметричных элементов вблизи места пе-
рестройки; (2) высокую концентрация СpG динуклеотидов; (3)
наличие внегенных последовательностей ДНК, гомологичных
фрагментам структурного гена; (4) мобильные элементы генома.
Естественно, что реализация этих структурных факторов в те
или иные типы мутаций возможна лишь в процессе репликации
(1,2) и рекомбинации (3) ДНК хромосом.
Как подробно рассмотрено в серии работ D.N Cooper и
M.Кrawczak (1990, 1991), наличие в первичной структуре ДНК
прямых повторов, идентичных повторяющихся последователь-
ностей, инвертированных повторов, шпилечных структур, квази-
палиндромных последовательностей и симметричных элементов
генома (например CTGAAGTC) нередко ведет к образованию пе-
тель при репликации ДНК вследствие скользящего нарушения
спаривания (slipping mispairing) родительской и дочерней це-
пей ДНК. Эти новые структурные элементы ДНК либо уничтожа-
ются ферментами системы репарации, что ведет к делециям, ли-
бо сохраняются и дублируются, что приводит к дупликациям и
инсерциям, при этом возникшие изменения закрепляются при
последующих раундах репликации. Авторы приходят к следующим
выводам: (1) возникновение подобных мутаций происходит
неслучайно, но зависит от особенностей первичной структуры
ДНК в месте перестройки; (2) в основе структурных перестроек
ДНК лежат ошибки репликации; (3) принципиально сходные моде-
ли эндогенного мутагенеза характерны как для делеций, так и
для инсерций. Считается, что именно механизм скользящего на-
рушения спаривания ответственен за мутации экспансии, приво-
дящие к быстрому увеличению числа тринуклеотидных повторов и
к нарушению работы соответствующих генов, а также за высокую
изменчивость, наблюдаемую во многих местах локализации мини-
и микросателлтных тандемных повторов.
Недавно показано, что повышенной эндогенной мутаген-
ностью обладают вообще все последовательности ДНК, находящи-
еся в определенном конформационном состоянии, а именно в
состоянии изгиба (bent DNA) (Milot et al.,1992). Известно,
что такая конформационная структура ДНК свойственна промо-
торным частям генов, местам начала репликации (origins of
replication), местам контакта хромосом с ядерным матриксом.
Именно эти участки ДНК являются местами посадки ферментов
топоизомераз, вовлеченных в процессы репликации, транскрип-
ции, рекобинации, в том числе, как оказалось, и в процесс
негомологичной (незаконной -illegitimate) рекомбнации. Уста-
новлено, что именно негомологичная рекомбинация может приво-
дить не только к внутригенным делециям, дупликациям и другим
мутациям на молекулярном уровне, но и является одной из
основных причин крупных структурных хромосомных перестроек
типа транслокаций, инверсий и других.
Замены или утраты отдельных оснований в геномной ДНК
могут возникать в результате нарушения процессов репликации
и репарации. Ошибки в ДНК матрице, вызванные действием пов-
реждающих внешних агентов, либо спонтанной деградацией осно-
ваний закрепляются в последующих циклах репликации. Основные
типы спонтанной деградации включают потерю оснований и про-
цесс дезаминирования. Особенно чувствительны к дезаминирова-
нию цитозиновые остатки. Установлено, что у позвоночных поч-
ти половина всех цитозиновых остатков в ДНК метилирована в
5-ом положении. Процесс метилирования особенно часто захва-
тывает области повторов 5'CpG 3', расположенные как внутри
генов, так и в их промоторных частях. При дезаминировании
5-метилцитозин превращается в тимин. В цикле последующей
репликации, возникший в результате дезаминирования мисмэтч
(T-G) может либо коррегироваться в нормальный вариант (С-G),
либо приводить к мутациям типа трансцизий (Т-G) или (С-А).
Естественно, что гены, имеющие в своей структуре большой
процент CpG оснований, особенно часто подвергаются спонтан-
ному мутированию типа трансцизий. В частности, преобладание
подобных точечных мутаций известно для генов факторов IX и
VIII свертывания крови, для гена фенилкетонурии и других.
Так, из 76 мутаций гена фактора IX в 21 случае найдены
трансцизии CpG - TpG или СрА (Green et al.,1990). Преоблада-
ние таких мутаций отмечено и в 22 CpG дуплетах гена фенила-
ланингидроксилазы у больных фенилкетонурией (Abadie et
al.,1989).
Другим важным фактором эндогенного мутагенеза является
наличие тесно сцепленных с генами гомологичных последова-
тельностей ДНК (псевдогенов). В мейозе такая ситуация неред-
ко приводит к неравной гомологичной рекомбинации и, как
следствие этого, к генной конверсии, сопровождающейся струк-
турными перестройками типа делеций, дупликаций и т.п. Подоб-
ный механизм мутаций, как оказалось, является доминирующим
для гена 21-гидроксилазы (Morel, Miller,1991), а также для
гена фактора VIII свертывания крови (Lakich et al.,1993).
Важная роль ошибок рекобинации в этиологии структурных поло-
мок гена особенно очевидна при анализе гена дистрофина, му-
тации которого ведут к миопатии Дюшенна. Известно, что в 60%
случаев мутации этого гена представляют собой делеции, зах-
ватывающие один или несколько соседних экзонов. Известно
также, что подавляющее большинство делеций сосредоточено в
двух "горячих" районах этого гигантского по размерам гена
(2,2 Мб), и при этом частота внутригенных рекомбинаций почти
в 4 раза больше, чем можно предполагать, исходя из его раз-
меров (Oudet et al.,1992). Любопытно отметить, что в одной
из этих горячих точек (интрон 7) недавно обнаружен кластер
транспозоноподобных повторяющихся последовательностей.
Удельный вес мобильных (транспозонподобных) элементов типа
Alu и Line повторов (см. Главу 2) в возникновении генных му-
таций до конца не выяснен. Имеются единичные наблюдения о
реальном перемещнии этих элементов по типу конверсии и их
интеграции в структурные гены аденозиндезаминазы, аполипоп-
ротеина С, факторов VIII и IX свертывания крови, кальмодули-
на (Vidaud et al.,1993).
Раздел 5.4 Механизмы поддержания и распространения му-
таций в популяциях.
Частоты и характер распределения мутаций в популяциях
зависят от многих факторов, главными из которых являются
частоты мутагенеза и давление естественного отбора. Значи-
тельное влияние на этот процесс оказывают также структурные
особенности популяций, такие как размеры, степень географи-
ческой и этнической изолированности, величина инбридинга,
характер миграции населения.
Для всех мутаций, возникающих за счет повышенного уров-
ня спонтанного мутагенеза, характерны следующие особенности
- неслучайный характер внутригенной локализации мутаций,
сходство типов нарушений при отсутствии полной молекулярной
идентичности между ними. В отличие от спонтанных мутаций,
вызыванных эндогенными причинами, для мутаций, индуцирован-
ных действием неблагоприятных факторов внешней среды, про-
мышленными и сельскохозяйственными вредностями, ионизирующим
облучением, химическими агентами и прочим, специфики в типах
мутаций и в характере их локализации не наблюдается. В попу-
ляциях, находящихся в области действия таких неблагоприятных
факторов, будет повышена частота мутаций в различных генах,
однако спектр индуцированных мутаций будет достаточно разно-
образным.
Рассмотрим теперь влияние отбора на процесс поддержа-
ния и распространения мутаций в популяциях. Многие гены мо-
ногенных наследственных заболеваний рецессивны, то есть му-
тации в них в гетерозиготном состоянии не оказывают вредного
влияния на жизнеспособность. Поэтому после возникновения му-
тация может распространяться в популяции до определенной
концентрации, практически не подвергаясь элиминирующему
действию естественного отбора. В дальнейшем частота этой му-
тации достигнет равновесного состояния и не будет повышаться
за счет выщепления гомозиготных особей, жизнеспособность и
репродуктивные качества которых резко снижены. При этом ско-
рость элиминации мутации из популяции резко замедляется при
снижении ее частоты и, практически, после возникновения му-
тация может сохраняться в популяции на протяжении многих
десятков и даже сотен поколений. Различные мутации могут
случайным образом получить большее распространение в изоли-
рованных популяциях или среди групп населения, отличающихся
повышенным уровнем инбридинга. В целом, при отсутствии дав-
ления отбора по отношению к гетерозиготным особям общая кон-
центрация мутантных аллелей в популяции определяется часто-
той их спонтанного возникновения, при этом пул мутаций будет
состоять из большого количества разнообразных аллелей, каж-
дый из которых будет представлен редкими или даже единичными
случаями в различных популяциях.
Однако, специфические мутации могут получить значи-
тельно более широкое распространение в тех случаях, когда
гетерозиготные особи имеют какие-либо селективные преиму-
щества. Таким эффектом может обладать сама мутация, но более
вероятна возможность неравновесности по сцеплению между этой
мутацией и селективными аллелями другого локуса. Гетерозиго-
ты могут получить преимущество при изменении условий окружа-
ющей среды, в каких -то экстремальных ситуациях или среди
определенных групп населения. Так например, мутации, повыша-
ющие устойчивость организма к действию инфекционных агентов,
могут получить широкое распространение в период массовых
эпидемий. Одновременно повысится частота всех аллелей других
локусов, находящихся в неравновесности по сцеплению с данной
мутацией. Мутантные аллели, обеспечивающие селективное преи-
мущество гетерозигот, становятся преобладающими во многих
популяциях, не полностью изолированных друг от друга. При
этом наибольшая частота таких аллелей будет наблюдатся в ра-
йонах, где влияние поддерживающего отбора было максимальным
(например, в эпицентре эпидемии). По мере удаления от этого
района концентрация таких мутантных аллелей будет умень-
шаться, причем их распределение в разных популяциях будет
коррелировать с характером миграции населения. Подобный ха-
рактер распределения определенного мутантного аллеля в
частично изолированных популяциях принято связывать с так
называемым эффектом основателя или родоначальника.
Исследование спектров распределения мутаций в различ-
ных популяциях позволяет делать предположения относительно
возможного происхождения таких повреждений и тех механизмов,
которые лежат в основе их распространения среди населения.
Рассмотрим наиболее вероятные интерпретации различных
вариантов распределения аллелей в популяциях. Мутации,
представленные у единичных больных или в группе родственных
индивидуумов и не имеющие специфической внутригенной локали-
зации, по-видимому, являются следствием естественного мута-
ционного процесса. Если в каких-то популяциях концентрация
мутаций в различных генах повышена, вероятно, они находятся
в зоне действия внешних неблагоприятных факторов, индуцирую-
щих возникновение нарушений в структуре ДНК. В тех случаях,
когда локализация и типы мутаций носят специфический харак-
тер можно предполагать наличие особых молекулярных механиз-
мов контроля повышенного уровня мутагенеза в определеннных
районах генома. Распространение специфических мутаций в изо-
лированных популяциях происходит за счет их ограниченного
размера и повышенного уровня инбридинга (эффект родоначаль-
ника). И, наконец, обнаружение градиентного распределения
мутаций, превалирующих в различных, частично изолированных
популяциях позволяет предполагать селективное преимущество
гетерозиготных носителей мутаций на определенных этапах эво-
люционного развития.
Таким образом, сопоставляя спектры распределения одно-
типных мутаций у жителей разных континентов, разных стран, у
людей, принадлежащих к различным расам и национальностям
можно определить степень генетической близости между всеми
этими группами и реконструировать их филогенетические отно-
шения (Cavalli-Sforza,Piazza,1993). Одним из практических
следствий этих исследований является возможность прогнозиро-
вать наиболее вероятные мутации в различных генах у пациен-
тов разного этнического происхождения, что приводит к суже-
нию спектра поиска специфических мутаций. Особый интерес в
этом смысле представляют наиболее распространенные мутации
(например delF508 при муковисцидозе; R408W - при фенилкето-
нурии и многие другие). Для профилактики наследственных за-
болеваний необходима разработка эффективных и простых мето-
дов молекулярной диагностики таких мутаций как у больных,
так и у гетерозиготных носителей с целью проведения скрини-
рующих программ среди населения и выявления максимально воз-
можного числа семей с повышенным риском рождения больного
ребенка.
ГЛАВА VII.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГ-
НОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
Раздел 7.1 Прямые и косвенные методы молекулярной диаг-
ностики.
Локализация и клонирование кДНК-овых последовательнос-
тей генов открывают принципиально новые возможности диагнос-
тики наследственных заболеваний, основанные на исследовании
мутантных аллелей у пациентов, членов их семей или у предпо-
лагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций.
Это в равной мере относится и к пренатальной диагностике,
которая может быть проведена с использованием молекулярных
методов анализа на самых ранних стадиях развития плода
(см.7.5). Эти же подходы вполне приемлемы для диагностики до
появления каких-либо клинических или биохимических симптомов
болезни (досимптоматическая диагностика), что позволяет вы-
работать и начать рациональную тактику лечения (упреждающая
терапия), а также эффективно выявлять гетерозиготных носите-
лей в семьях высокого риска, что является важным фактором
профилактики наследственных болезней. Решающими преимущест-
вами молекулярной диагностики являются её универсальность,
возможность использовать для анализа любые ДН-содержащие
клетки или ткани, причем анализ может быть произведен на лю-
бых стадиях онтогенеза, начиная со стадии зиготы.
Принципиально различают прямую и непрямую ДНК-диагнос-
тику мононогенных наследственных болезней. В общем случае,
использование прямых методов диагностики возможно лишь для
клонированных генов с известной нуклеотидной последователь-
ностью полноразмерной кДНК, при этом необходимо предвари-
тельное генотипирование мутантных аллелей у родителей. В
случае прямой диагностики обьектом молекулярного анализа яв-
ляется сам ген, точнее мутации этого гена, идентификация ко-
торых и составляет основную задачу исследования. Такой под-
ход особенно эффективен при наличии точной информации о при-
роде, частоте и локализации наиболее распространенных (доми-
нирующих по частоте) мутаций соответствующих генов, а также
о наличии в них особенно легко мутирующих "горячих" точек. К
таковым относятся мутация delF508 и ряд других мутаций при
муковисцидозе, делеционные мутации при миодистрофии Дюшенна,
мутация R408W при фенилкетонурии, инверсионная мутация при
гемофилии А, протяженная делеция при адрено-генитальном
синдроме, экспансии триплетных повторов в случае "динамичес-
ких" мутаций при синдроме ломкой X-хромосомы и при ряде дру-
гих нейродегенеративных заболеваний (см. Главы IV и X). Ме-
тоды, используемые для направленного поиска этих мутаций,
подробно рассмотрены в Главе IV. В ряде случаев (муковисци-
доз, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия) эти методы
удалось автоматизировать, что позволяет одноверменно тести-
ровать сразу несколько (до 30 и более) различных мутаций.
При этом появляется реальная возможность выявлять свыше
95-98% мутантных хромосом, что делает целесообразным и эко-
номически оправданным скринирование всей популяции отдельных
стран на выявление мутантных особей для последующей органи-
зации эффективных профилактических мероприятий, направленных
на предупреждение рождения больных детей. Подобные программы
по муковисцидозу уже успешно проводятся в ряде стран Запад-
ной Европы (Великобритания, Дания, Франция) и Северной Аме-
рики.
Главное преимущество прямого метода - это высокая, до-
ходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходи-
мости анализа всей семьи на предмет её информативности
(см.ниже). Последнее обстоятельство особенно важно для про-
ведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных
наследственных болезней (муковисцидоз, миодистрофия Дюшен-
на, гемофилия А и др). Такие семьи нередко обращаются за ме-
дико-генетической помощью уже после того как больной ребенок
умер. Так, по нашим наблюдениям до 80% семей с высоким рис-
ком муковисцидоза обращаются по поводу необходимости дородо-
вой диагностики уже после смерти больного ребенка (Baranov
et al., 1992).
Однако, существует огромное количество наследственных
болезней, для которых мутации не описаны либо не найдено ма-
жорных мутаций в исследуемых популяциях. И даже во всех тех
случаях, когда имеются мажорные мутации, наряду с ними, опи-
саны многочисленные редко встречающиеся (вплоть до единичных
случаев), так называемые минорные мутации. Кроме того, всег-
да сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвест-
ных мутаций, а клонирование гена больного человека для целей
прямого секвенирования, даже ограниченного только смысловой
его частью - кДНК, далеко не всегда возможно в силу очевид-
ных финансовых и временных ограничений такого подхода. Эти
трудности успешно преодолеваются благодаря наличию непрямых
(косвенных) методов молекулярной диагностики.
Этот исторически более ранний подход основан на исполь-
зовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью
которых проводится идентификации мутантных хромосом (точнее
хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, то
есть у родителей больного и его ближайших родственников. В
настоящее время косвенные методы молекулярной диагностики
принципиально возможны практически для всех моногенных забо-
леваний с известной локализацией контролирующего гена, для
каждого из которых уже разработана удобная система вне- и
внутригенных полиморфных индексных маркеров (см.Главу III).
Более того, косвенные методы молекулярной диагностики
пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не иденти-
фицированы и мутации не известны. Единственным и непременным
условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрик-
ции либо коротких тандемных повторов типа STR, находящихся в
непосредственной близости от мутантного гена или, что еще
лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих
полморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена
и проследить их передачу потомству (см. Главу 111). Ранние
иследования непрямым методом проводились почти исключительно
с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллель-
ной системы, информативная емкость которой не превышает 50%,
а реальное число гетерозигот по данному признаку в популя-
ции, зачастую, оказывается существенно ниже 0.5. Следова-
тельно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носи-
телей наследственного заболевания, вызванного рецессивной
мутацией какого-нибудь гена, может быть доступна непрямой
молекулярной диагностике с использованием одного полиморфно-
го сайта рестрикции. Повышение информативности в случае
ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения
числа полиморфных сайтов. Как првило, для диагностики необ-
ходим не один, а 3-4 полиморфных сайта, что далеко не во
всех случаях возможно. Многие из полиморфных сайтов локали-
зованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер
может в заметном проценте случаев исказить результаты диаг-
ностики. Кроме того, практическое использование рестрикцион-
ных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой
стоимостью соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.
Все эти недостатки могут быть устранены при использова-
нии в качестве молекулярных маркеров высокополиморфных тан-
демно повторяющихся коротких три- и тетрамерных повторов
(STR) (см. Главу III). Для многих генов найдены уникальные
паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу "коро-
вых" едининц повторяющихся последовательностей нуклеотидов.
Такие "количественные" полиморфизмы , как уже упоминалось
(см.Главу III), очень широко распространены по всему геному
и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих
генов. Появление в конце 1994г 0.7-сантиморганной карты ге-
нома человека, построенной на базе высокополиморфных динук-
леотидных (C-A)n повторов, сделало реальным маркирование,
практически, любого картированного гена. Особенную диагнос-
тическую ценность представляют внутригенные маркеры, для ко-
торых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными
аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность ди-
агностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные
полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное
неравновесие по сцеплению с определенными мутантными аллеля-
ми гена, что значительно облегчает их идентификацию в отяго-
щенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных
мини- и микросателитных систем нередко превышает 0.8. Их
применение позволяет маркировать, то есть сделать информа-
тивными (см. 7.4) для ДНК-диагностики практически все семьи
высокого риска при условии наличия больного ребенка или дос-
тупности для молекулярного анализа его патанатомического ма-
териала .
Изучение полиморфных маркеров у больного пробанда и его
родителей и выяснение аллельной природы молекулярного марке-
ра, так называемое "определение фазы сцепления" (см.раздел
7.4), составляет основу для дальнейшей диагностики косвенны-
ми методами (Евграфов, Макаров,1987). Применение косвенных
методов молекулярной диагностики предусматривает также в ка-
честве обязательного предварительного этапа исследование
частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анали-
зируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носите-
лей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и
неравновесности по сцеплению между маркерными сайтами и му-
тантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с по-
мощью методов блот-гибридизации по Саузерну, либо ПЦР
(см.разделы 1.3.; 1.7; 2,5). В первом случае в распоряжении
исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во вто-
ром - должны быть известны нуклеотидные последовательности
районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты,
для выбора олигопраймеров (см. Главы II,1V).
Раздел 7.2. ДНК-диагностика при различных типах насле-
дования.
Напомним, что значительное число моногенных заболеваний
наследуется по рецессивному типу. Это значит, что при ауто-
сомной локализации соответствующего гена болеют только гомо-
зиготные носители мутаций. Гетерозиготы клинически здоровы,
но с равной вероятностью передают своим детям мутантный или
нормальный варианты гена. Таким образом, на протяжении дли-
тельного времени мутация в скрытом виде может передаваться
из поколения в поколение. При аутосомно-рецессивном типе
наследования в родословных тяжелых больных, которые либо не
доживают до репродуктивного возраста, либо имеют резко сни-
женные потенции к размножению, редко удается выявить больных
родственников, особенно, по восходящей линии. Исключение
составляют семьи с повышенным уровнем инбридинга, который
возникает либо за счет высокой частоты близкородственных
браков, либо за счет вступления в брак людей из одинаковых
изолированных популяций ограниченной численности. Больные
дети с вероятностью 25 % рождаются в тех семьях, где оба ро-
дителя являются гетерозиготными носителями мутаций одного и
того же гена. Возможно также рождение больного ребенка в та-
кой семье, где только один из супругов несет мутацию, а вто-
рая мутация возникла в гамете его партнера в момент, пред-
шествующий оплодотворению. Доля таких семей в общей группе
риска относительно невелика, а риск повторного рождения в
них больного ребенка не превышает общей частоты спонтанного
возникновения мутаций в данном гене. Для болезней, сцеплен-
ных с полом, то есть контролируемых генами, локализоваными в
Х-хромосоме, характерно то, что болеют преимущественно маль-
чики, тогда как носителями являются девочки.
Y-хромосома содержит очень мало генов, большинство из
которых (около 10) картировано в так называемой псевдоауто-
сомной области короткого плеча, гомологичной таковой на ко-
ротком плече X-хромосомы. Важнейшим истинным геном Y-хромо-
сомы, то есть геном, представленным только на этой хромосо-
ме, является ген SRY (Yp21.1), детерминирующий развитие пола
по мужскому типу. Мутации этого регуляторного гена приводят
к нарушениям половой дифференцировки (XY-женщины), а его пе-
ренос вследствие ошибок рекомбинации псевдоаутосомных райо-
нов на короткое плечо X-хромосомы обусловливает синдром ре-
версии пола- Sex reverse (XX-мужчины) (McElreavey et al.,
1993). Практически важно, что присутствие даже небольшого
околоцентромерного фрагмента длинного плеча Y-хромосомы при
кариотипе XX является безусловным показанием для удаления
зачатков гонад у таких индивидуумов в связи с высокой веро-
ятностью экспрессии гена Gba, ведущего к их злокачественному
перерождению - гонадобластоме (Giquel et al., 1992). В отли-
чие от Y-хромосомы, большая по размеру X-хромосома человека
несет до 5% всех структурных генов, многие из которых уже
идентифицированы (см. Главу III).
Все рецессивные аллели Х-хромосомы у мальчиков проявляют-
ся, так как находятся в гемизиготном состоянии. Девочки мо-
гут болеть в том случае, если они гомозиготны по мутации.
Такая возможность может осуществиться в семье, где болен их
отец, а мать является носительницей мутации и передала доче-
ри свой мутантный аллель. Если отец больной девочки здоров,
можно предполагать, что мутация возникла в той его гамете,
которая участвовала в оплодотворении. Х-сцепленные заболева-
ния у девочек (миодистрофия Дюшенна, гемофилия А) могут быть
следствием сочетанного проявления мутации этих генов у одно-
го из родителей и делеции соответствующих фрагментов хромо-
сом у другого. В этих редких случаях у девочек, как и у
мальчиков, мутации Х-сцепленных генов будут находиться в ге-
мизиготном состоянии
При доминантном наследовании для развития болезни дос-
таточно одного мутантного аллеля. Такие больные с вероят-
ностью 50% рождаются в семьях, где один из родителей болен.
Очень редко больные дети с доминантным типом наследования
могут родиться и у здоровых родителей в результате мутирова-
ния одной из гамет. Однако, вероятность повторного рождения
больного ребенка в такой семье такая же, как и для популяции
в целом. Пренатальная диагностика доминантных болезней про-
водится достаточно редко по ряду причин. Во-первых, такие
болезни составляют относительно небольшой процент среди всех
моногенных заболеваний. Во-вторых, тяжелые болезни, сопро-
вождающиеся летальным исходом в раннем возрасте или приводя-
щие к бесплодию, не передаются по наследству, а появляются
каждый раз заново вследствие мутации при созревании гамет.
Необходимость же предотвращения рождения больных, которые не
только доживают до репродуктивного возраста, но и способны
оставить потомство, является вопросом дискуссионным. Прове-
дение пренатальной диагностики таких заболеваний принимается
с учетом многих конкретных обстоятельств. Актуальность этой
проблемы стала особенно очевидной в последние годы, когда
была открыта многочисленная группа доминантных нейродегене-
ративных заболеваний (см. Главу IV), которые проявляются
сравнительно поздно, нередко уже в репродуктивном возрасте,
тяжело протекают и, по-сути, не имеют сколько-нибудь реаль-
ной терапии. Для таких заболеваний первостепенное значение
приобретают методы досимптоматической диагностики с исполь-
зованием методов ДНК-анализа (см.Главу X).
Значительно больше распространены моногенные болезни с
частичным доминированием и неполной пенетрантностью. Для по-
добных заболеваний риск рождения больного ребенка в отяго-
щенной семье зависит от конкретных значений этих параметров,
которые, в свою очередь, определяются молекулярными механиз-
мами, лежащими в основе формирования такого рода отклонений
от Менделевского типа наследования.
Разработка молекулярных методов диагностики болезней,
вызванных мутациями в митохондриальных генах, как показывают
исследования последних лет (McKusick, 1994), приобретает
особое значение. Как правило, в основе различных митохондри-
альных болезней лежат нарушения в системе окислительного
фосфорилирования. Поскольку некоторые ткани обладают повы-
шенной чувствительностью к подобным нарушениям, сходная кли-
ническая картина заболеваний может наблюдаться вследствие
мутаций разных митохондриальных генов. Наследование таких
болезней значительно отличается от Менделевского типа, в
превую очередь, из-за материнского характера наследований
митохондрий, наличия в зиготе и соответственно во всех клет-
ках организма большого числа копий митохондриальных хромо-
сом, из-за особенностей сегрегации этих хромосом при делении
клеток и, наконец, из-за тех количественных и качественных
изменений в митохондриальной ДНК, которые соровождают про-
цессы онтогенетической дифференцировки клеток и старения ор-
ганизма.
Для всех "митохондриальных болезней" характерен мате-
ринский тип наследования и присутствие мутантных аллелей
только в части хромосом (так называемая гетероплазмия), доля
которых может варьировать в разных тканях. Как правило, су-
ществует определенное пороговое значение доли мутантных хро-
мосом, превышение которого ведет к появлению и прогрессиро-
ванию заболевания. Сокращение числа митохондрий, происходя-
щее в норме при старении, может способствовать увеличению
доли мутантных хромосом в определнных тканях и тем самым
быть причиной болезни. Неслучайно поэтому, что для многих
"митохондриальных болезней", характерно позднее начало. В
силу функциональных особенностей митохондриальных генов час-
то наблюдается кумулятивный эффект двух и более мутаций, ло-
кализованных в разных генах. Важным представляется также то
обстоятельство, что в митохондриальных генах OXPHOS-комплек-
са частота возникновения мутаций выше, чем в ядерных генах,
кодирующих субьединицы окислительного фосфорилирования
(McKusick, 1994).
Раздел 7.3. Группы риска, поиск гетерозиготных носите-
лей мутаций.
Как следует из вышеизложенного, точная диагностика в
сочетании с детальным анализом типа наследования того или
иного заболевания имеет определяющее значение для формирова-
ния групп риска, то есть отбора семей, в которых вероятность
рождения больных детей повышена. Прежде всего, это те семьи,
где уже есть или был ребенок, страдающий каким-либо моноген-
ным наследственным заболеванием. Для аутосомно-рецессивных
болезней с большой долей вероятности можно считать, что оба
родителя этого ребенка являются гетерозиготными носителями
мутантных аллелей соответствующего гена и риск повторного
рождения больного ребенка в такой семье составляет 25%, не-
зависимо от исхода предыдущих родов. Поэтому в таких случаях
рекомендуется обязательная пренатальная диагностика плода
при каждой последующей беременности.
Для сцепленных с полом заболеваний важной практической
задачей является выявление случаев спонтанного возникновения
мутаций в родительском поколении. Для таких распространенных
заболеваний, как миодистрофия Дюшенна и гемофилия А, почти
1/3 всех случаев имеет спонтанное происхождение. При этом
мутации гена дистрофина, как правило, возникают в оогенезе,
то есть у матери, а мутации гена фактора Y111, обычно, появ-
ляются во время сперматогенеза у деда больного ребенка (см.
Главу X). В отличие от тех семей, в которых мать гетерози-
готна, вероятность повторного рождения больного ребенка в
семьях со спонтанной мутацией не превышает среднепопуляцион-
ной частоты, и потому нет необходимости проводить пренаталь-
ную диагностику плода при последующих беременностях. Специ-
ального рассмотрения в этой связи заслуживает,однако, вопрос
гонадного мозаицизма, то есть наличия в гонадах матери гене-
тически нормальных и мутантных ооцитов. Особенно велик риск
такого состояния в случае миодистрофии Дюшенна. Гонадный мо-
зацизм в силу своей органной специфики достаточно трудно до-
казать или опровергнуть. Между тем, считается что 6,7% спо-
радических случаев иодистрофии Дюшенна обусловлена гонадным
мозаицизмом у матери (Essen et al.,1992).
Подробное медико-генетическое консультирование семей, в
которых зарегистрированы спонтанные случаи рождения детей с
Х-сцепленными заболеваниями в сочетании с соответствующими
лабораторными, в том числе и молекулярными исследованиями,
как правило, позволяют ответить на вопрос о происхождении
мутации. Так,гетерозиготное носительство у матери может быть
заподозрено, в частности, по содержанию соответствующих бел-
ковых продуктов (например, фактора Y111 свертывания крови
при гемофилии А; дистрофина в мышцах и креатинкиназы в сыво-
ротке крови при миодистрофии Дюшенна) либо при помощи специ-
альных ДНК-методов, позволяющих идентифицировать мутантный
аллель у матери. Если дифференцировка этих случаев невозмож-
на или доказано, что мутация у больного ребенка не является
спонтанной, следует предпологать, что мать является гетеро-
зиготной носительницей и с 50%-ой вероятностью будет переда-
вать болезнь своим сыновьям. В этом случае пренатальная ди-
агностика обязательна и должна сопровождаться определением
пола плода. Следует, однако, подчеркнуть, что установление
мужского пола плода на сегодняшний день отнюдь не является
показанием для прерывания беременности, поскольку в 50% слу-
чаев они получают от матери X-хромосому с нормальным аллелем
гена и являются вполне здоровыми. Определить, какую именно X
-хромосому (с нормальным или мутантным аллелем) получил бу-
дущий мальчик, и является задачей молекулярной диагностики.
С помощью прямых и непрямых методов ДНК-диагностики эта за-
дача уже практически решается для очень многих сцепленных с
полом заболеваний (см.Главу X).
Наиболее эффективной мерой профилактики наследственных
заболеваний является выявление гетерозиготных носителей му-
таций, так как при этом удается предотвратить рождение пер-
вого больного ребенка в семьях высокого риска. Родственники
больного с большой вероятностью могут быть гетерозиготными
носителями мутантных аллелей, поэтому в тех случаях, когда
это возможно, они подлежат обследованию в первую очередь.
Для болезней, сцепленных с полом, это родственники по женс-
кой линии - сестры, дочери и тетки пробанда. Их диагностика
особенно важна, так как вероятность рождения больных сыновей
в потомстве носительниц мутаций очень высока и не зависит от
генотипа супруга. При аутосомно-рецессивных заболеваниях по-
ловина сибсов родителей и 2/3 здоровых сибсов больного будут
гетерозиготными носителями мутации. Поэтому в тех семьях,
где принципиально возможна молекулярная идентификация му-
тантных аллелей, необходимо обследовать максимальное число
родственников больного пробанда для выявления гетерозиготных
носителей. Иногда в больших семьях с разветвленными родос-
ловными удается проследить наследование неидентифицируемых
мутаций с помощью косвенных методов молекулярной диагности-
ки.
Для заболеваний, распространенных в определенных попу-
ляциях или в каких-то этнических группах и обусловленных
присутствием одного или нескольких преобладающих и легко
идентифицируемых мутантных аллелей, возможно проведение то-
тального скрининга на гетерозиготное носительство этих мута-
ций среди определенных групп населения, например, среди бе-
ременных женщин или среди новорожденных. Считается, что по-
добный скрининг экономически оправдан в том случае, если при
проведении процедуры выявляются аллели, составляющие не ме-
нее 90 - 95 % всех мутаций данного гена в исследуемой попу-
ляции. Выявленные при подобных обследованиях носители мута-
ций также составляют группу риска, и в последующем должны
быть аналогичным образом протестированы их супруги. Однако,
даже в том случае, если мутация найдена только у одного из
родителей, вероятность рождения больного ребенка несколько
выше популяционной частоты, но, конечно, значительно меньше
25%. Конкретное значение этого риска зависит от общей часто-
ты мутаций соответствующего гена в популяции. В таких семьях
по желанию родителей также может быть проведена пренатальная
диагностика и прослежено наследование мутантного аллеля. При
отсутствии этой мутации у плода прогноз считается благопри-
ятным, независимо от того, какие аллели ребенок получит от
второго супру
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122339 прочтено)