Страница: 6/52
поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сег-
менты ДНК также могут быть клонированы с использованием ме-
тода скользящего зондирования.
Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно
отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых
других последовательностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;
Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,
1992). Условно эти критерии могут быть разделены на три
группы. В первой группе исследуют структурные особенности
генных последовательностей. Вторая группа критериев основана
на поиске функциональных участков генов. В третьем случае
анализируют характер нуклеотидных последовательностей тести-
руемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков ге-
нов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым
скринированием кДНК-овых библиотек. Функциональная диаг-
ностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping),
промоторных участков, поли-A сигнальных последовательностей,
а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в
них соответствующих транскриптов. И, наконец, поиск генов
может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных
фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклео-
тидной последовательности и сопоставлением её с присутствую-
щими в базах данных идентифицированными генами других видов
живых существ.
Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов,
представленные в геноме уникальными последовательностями,
достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует
высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми
генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан,
так называемый зоо-блот - скрининг клонированных последова-
тельностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную
гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов жи-
вотных - приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов,
птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последова-
тельности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в
инсертированных фрагментах ДНК CpG островков, часто маркиру-
ющих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно ге-
нов домашнего хозяйства ( см.Главу II,2.4), и исследуют на-
личие открытых рамок считывания -ORF (open reading frames).
Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть
осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей
нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клони-
рованные ДНК из этого интервала могут быть сразу использова-
ны для анализа РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).
Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК
гену является идентификация гомологичных РНК транскриптов в
тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой
целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум
критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих
тканей, а также скринируют соответствующие кДНК-овые библио-
теки. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным
первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из
пораженных органов и тканей. При обнаружении последователь-
ностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою
очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления
всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К
сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридиза-
ция может не дать положительных результатов.
Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным крите-
риям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК,
являющиеся частями гена. Однако, всегда существует опасность
выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализован-
ного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные
доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК
специфическому гену. Такие доказательства могут быть получе-
ны, например, при определении нуклеотидной последователь-
ности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последова-
тельностью кодируемого этим геном белка. Веским доказа-
тельством в пользу правильности проведенной идентификации
гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в
изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих
соответствующим наследственным заболеванием. Так, например,
при идентификации гена муковисцидоза, у 70% больных в клони-
руемой кДНК последовательности была обнаружена однотипная
мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, реша-
ющим аргументом правильности идентификации нужного гена яв-
ляется успешно осуществленная с его помощью генокоррекция
первичного биохимического дефекта, выполненная на соот-
ветствующих культурах мутантных клеток, или получение стой-
кого терапевтического эффекта у трансгенных животных - био-
логических моделей данного наследственного заболевания.
Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с ге-
номными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта
оценка имеет важное значение для реконструирования полнораз-
мерной кДНК. Её клонирование, по-сути, означает идентификаию
гена, так как позволяет определить его границы в геномной
ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и ре-
гуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последова-
тельность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать амино-
кислотную последовательность соответствующего белка и таким
образом определить первичное биохимическое звено в патогене-
зе соответствующего наследственного заболевания.
Описанный способ изучения молекулярных и биохимических
основ наследственных заболеваний получил название обратной
генетики, а сам процесс в отличие от традиционного пути от
белка к гену, так называемого функционального клонирования,
был назван позиционным клонированием, тем более, что термин
обратной генетики уже использовался ранее для обозначения
метода анализа функции гена путем направленного введения в
него мутаций (Collins, 1992).
Возможность использования функционального клонирования
зависит от доступности информации о белковом продукте и/или
о функции соответствующего гена. Для подавляющего боль-
шинства моногенных болезней определение первичного биохими-
ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу
из-за недостаточного понимания функционирования огромного
числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия,
низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделе-
ния и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о
клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохи-
мический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных
о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности
генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их
сегментов, реальные соотошения функционального и позиционно-
го клонирования в идентификации генов, ответственных за
наследственные заболевания, быстро меняются в сторону бе-
зусловного доминирования последнего.
Успех позиционного клонирования определяется возмож-
ностями картирования гена, при этом функция гена исследуется
уже после его идентификации и клонирования. На рис. 3.8
представлена общая схема позиционного клонирования, за-
имствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для
нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления
используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения
хромосомной принадлежности картируемого гена более
точная локализациия может быть установлена с помощью при-
цельного отбора дополнительных индексных маркеров из опреде-
ленного цитогенетического сегмента. Картирование гена, оп-
ределяющего наследственное заболевание, может быть значитель-
но ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически
видимой структурной перестройки в области локализации этого
гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие паци-
енты, как правило, встречаются редко, но описание даже одно-
го такого случая может исключить необходимость картирования
гена путем последовательного анализа его сцепления с генети-
ческими маркерами целого генома и позволит перейти не-
посредственно к молекулярному клонированию. Именно таким об-
разом были идентифицированы гены хронического грануломатоза,
миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней-
рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных
болезней.
С другой стороны, в ряде случаев удается исключить дли-
тельный процесс молекулярного клонирования, используя метод
"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахож-
дение транскрибируемых областей генома, улавливание экзонов
и регуляторных участков генов, секвенирование и картирование
методами гибридизации in situ большого количества анонимных
кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифи-
ческих библиотек, все это в комплексе приводит к значитель-
ному увеличению степени насыщенности различных сегментов
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122403 прочтено)