Страница: 2/7
Полосы 2.1, 2.2, 2.3 Представлены различными формами периферического белка анкирина. Данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что сеть спектрина расположена на определенном расстоянии от мембраны и, по-видимому, взаимодействует интегральными белками мембраны. Латеральная подвижность интегральных белков зависит от присутствия спектрина: это подтверждает наличие такого взаимодействия. При обработке мембран химотрипсином был выделен белковый фрагмент с мол. массой 72 kD, который ингибировал взаимодействие спектрина с эритроцитарной мембраной, обедненной спектрином. Белок был назван анкирином, от греческого ankyra, что значит заякоривать. Другая группа исследователей назвала его синдеином, от греческого syndeo, что значит связываться вместе. Молекула анкирина (мол. масса 200 kD) имеет сферическую форму и состоит из двух доменов: нейтрального и фосфорилированного. Фосфорилированным доменом анкирин взаимодействует с b-субъединицей спектрина на расстоянии 20 нм от С-конца молекулы. Нейтральный домен анкирина осуществляет связь с белком полосы 3. [5,6]
Белок полосы 3 Белок 3 (анионтранспортный белок) – один из основных интегральных белков эритроцитарной мембраны – является гликопротеидом с мол. массой 90 kD. Показано, что этот белок принимает участие в обеспечении анионного транспорта, в связывании цитоскелетного каркаса с мембраной, цитоплазматических белков гемоглобина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Не все молекулы белка 3 взаимодействуют с анкирином. Если бы все молекулы белка 3 были связаны с анкирином и, следовательно, со всей спектриновой сетью, это исключило бы возможность латеральных перемещений самого белка, образования кластеров и транспортных функций. Связь спектрина с мембраной осуществляется, вероятно, не только через анкирин, но также с помощью дополнительных взаимодействий. Имеющиеся на сегодняшний день данные свидетельствуют о том, что белок 4.1 обеспечивает связь спектрина с интегральным белком мембраны. [5] Все перечисленные дополнительные взаимодействия носят слабый характер и, видимо, играют второстепенную роль по сравнению со взаимодействием спектрин―анкирин―белок 3.
Белок полосы 4.1 Необходим для нормальной стабилизации мембраны, закрепляет связь спектрина с актином. На электрофореграмме данный белок разделяется на две полосы: 4.1а (Mr=80 kD) и 4.1b (Mr=78 kD). Переход 4.1а в 4.1b осуществляется с помощью деамидирования. Это глобулярный белок с мол. массой 80 kD, составляющий около 5% от белковой массы цитоскелета эритроцитов. Его изоформы сходны по аминокислотному составу. Обе изоформы способны взаимодействовать со спектрином. Каждая из них содержится в количестве примерно 100 000 молекул на 1 клетку. [5]
Белок полосы 4.2 Паллидин – это олигомер (Mr=72 kD), в клетке присутствует в димерной и тримерной формах с Mr=185 kD. Соединяется с цитоплазматическим доменом белка полосы 3, анкирином, спектрином и белком полосы 4.1. [14]
Белок полосы 4.5 В его состав входят интегральные белки – переносчики нуклеозидов и глюкозы через эритроцитарную мембрану. Основная часть белков полосы 4.5 представлена транспортерами глюкозы (Mr=55 kD). [14]
Белок полосы 4.9 Центральный компонент цитоскелета с Mr=48 kD. Этот белок выделен в виде тримера с Mr=145 kD. Стабилизирует взаимодействия спектрина с актином и влияет на степень его полимеризации. Это фосфопротеин. Белок присутствует в эритроцитах в количествах, приблизительно равных количеству спектрина. О функциях этого белка практически ничего не известно. Возможно, он принимает участие в укреплении цитоскелетного каркаса (сети цитоскелета). Показано, что очищенный полипептид полосы 4.9 может взаимодействовать с актиновыми нитями, снижая скорость полимеризации актина и, возможно, стабилизируя короткие актиновые нити в эритроцитах. [5]
Полоса 5 Актин – представлен в эритроцитах b-изоформой и по физико-химическим свойствам схож с актином поперечнополосатых мышц. Так как функциональной формой актина является его полимер, изначально пытались выяснить, есть ли в эритроцитах филаментный актин. Электронно-микроскопические исследования показали, что актин присутствует в эритроцитах в виде филаментов, содержащих от 12 до 17 мономеров актина. [5] Выделенные мембраны эритроцитов, а также комплекс спектрина, актина и белка 4.1 способны индуцировать полимеризацию мономерного актина, подобно олигомерам актина. Обработка цитохалазином В подавляет полимеризацию. Так как типичный фибриллярный актин не выявляется в нативных эритроцитах, а в опытах in virto можно индуцировать образование длинных филаментов, связанных с мембраной, следует, по-видимому, предположить, что в эритроцитах существуют какие-то механизмы, ограничивающие рост филаментов, подобно тому, как это делает цитохалазин В. Актиновые олигомеры связываются с N-концом молекулы спектрина латерально. Каждый тетрамер спектрина имеет два сайта связывания для актиновых олигомеров. Спектрин может связываться с Ф-актином по всей длине актиновой нити, и эти связи, видимо, существенны для образования цитоскелетной сети. Важная роль во взаимодействии актина и спектрина принадлежит белку полосы 4.1, который связывается со спектрином в тех же участках, что и актин. Связь спектрина с актином в отсутствие белка 4.1 слабая и значительно усиливается в его присутствии, поэтому взаимодействие спектрина и актина называют 4.1-зависимым. Комплексы белка 4.1, спектрина и актина обладают гораздо большей устойчивостью к диссоциации при седиментации в сахарозе, чем комплексы актина и спектрина.
Возникает вопрос о том, какие факторы оказывают влияние на полимеризацию эритроцитарного актина. Относительно низкая концентрация актина в эритроцитах не может, вероятно, иметь решающего влияния на длину филаментов. Предположим, что на полимеризацию актина могут влиять такие актинсвязывающие белки, как спектрин и белок 4.1. Оказалось, что эти белки способны регулировать скорость полимеризации актина, сокращая лаг-фазу, уменьшая скорость элонгации и не вызывая при этом никаких изменений в последовательности этапов полимеризации. Спектрин и белок 4.1 вызывают нуклеацию глобулярного актина в условиях, когда концентрация актина ниже критической и спонтанная полимеризация не происходит. Таким образом, можно предположить, что спектрин и белок 4.1 представляют собой комплекс белков, блокирующих медленный конец актиновой нити в отличие от большинства "запирающих" белков, взаимодействующих с быстрым концом. Однако позже были получены данные, которые противоречат этому предположению. Шен с соавторами выделили фрагменты цитоскелета эритроцитов при обработке растворами с низкой ионной силой при 37 °С. [5] Электронно-микроскопические исследования полученных фрагментов показали, что часть из них содержит филаменты актина, вдоль которых кластерами располагаются спектриновые молекулы. При инкубации этих препаратов с глобулярным актином (при концентрации актина в растворе выше критической) происходил рост актиновых нитей на обоих концах. Тсукита с соавторами изучали полимеризацию актина на мембранах эритроцитов, закрепленных на электронно-микроскопических сектах. При инкубации этих препаратов с глобулярным актином на внутренней поверхности мембран, содержащих цитоскелетные белки наблюдался рост актиновых филаментов. [5] При концентрациях глобулярного актина, близких к критическим, рост наблюдался только на медленном конце, а при дальнейшем увеличении концентрации – на обоих концах нити. При обработке мембран "кэпирующим" белком с мол. массой 45 kD, связывающимся с быстрым концом актиновых микрофиламентов, рост наблюдался только на медленном конце. Данные Шена и Тсукиты приводят к выводу о том, что в эритроцитах актин существует в виде филаментов со свободными концами. Следовательно, спектрин и белок 4.1 не являются кэпирующими белками, однако несомненно влияют на состояние актина в эритроцитах, стабилизируя актиновые филаменты.
Белок полосы 6 Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД), молекулярная масса составляет 35 kD. Располагается на цитоплазматическом домене анионтранспортного белка, в составе мультиферментного комплекса. Данный белок является ферментом гликолиза и принимает участие в регуляции окисления гемоглобина. [14]
Полоса 7 Основной составляющей полипептид – тропомиозин. Долгое время оставалась неизвестной природа белка зоны 7. Было показано, что этот белок связывается с антителами к тропомиозину, выделенному из мускульного желудка цыпленка. Молекулярная масса белка совпадала с молекулярной массой тропомиозинов, выделенных из мозговых тканей, из макрофагов и кровяных пластинок. Тропомиозин эритроцитов – димер с мол. массой 60 kD, состоящий из двух субъединиц с мол. массой 29 и 27 kD и связывающийся с мышечным актином (Ф-актином) при соотношении: 1 молекула тропомиозина на 6-7 мономеров актина. Так как в эритроцитах филаменты актина содержат до 15-17 мономеров, они могут связывать две молекулы тропомиозина. [5]
Полоса 8 Представлена пептидной частью фермента глутатион-S-трансферазы (Mr=23 kD). Взаимосвязь белка полосы 8 с мембраной является кальций – зависимой.
В 1985 г. было показано, что еще одним компонентом цитоскелета эритроцитов является миозин. С помощью моноклональных антител к тяжелой цепи миозина Фаулер обнаружил в эритроцитах полипептид, который был выделен и охарактеризован. Белок состоит из тяжелой цепи с мол. массой 200 kD и из двух легких цепей с мол. массами 26 и 19,5 kD. В растворах с низкой ионной силой он образует биполярные филаменты и обладает АТФазной активностью. В эритроцитах миозин присутствует примерно в количестве 6000 молекул на 1 клетку, т.е. на 1 молекулу миозина, как и в других клетках, приходится около 80 мономеров актина. [5]
Реферат опубликован: 8/04/2005 (17169 прочтено)