Страница: 2/3
Подсчет эритроцитов производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т.е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах сетки, расположенных по диагонали. Для того чтобы не считать одни и те же эритроциты, лежащие на линиях, принято считать клетки только на определенных двух линиях (например, на левой и верхней).
Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят, исходя из разведения крови (200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата (1/4000 мкл), по формуле:
где Х - число эритроцитов в 1 мкл крови; а - число сосчитанных эритроцитов.
Эритроциты рекомендуется считать в течение 2-З часов после взятия крови. При гемолитических и мегалобластных анемиях - сразу после взятия, так как эритроциты легко разрушаются.
Ручные методы подсчета клеток чрезвычайно трудоемки и не всегда дают достаточно точные результаты, так как при визуальном подсчете постоянно присутствует субъективный фактор. Кроме того, малейшие отклонения от правил подготовки камеры и подсчета клеток влияют на конечный результат исследования. Вместе с тем, эти методы не требуют сложного оборудования, реактивов и могут быть применены практически в любых условиях.
Основными источниками ошибок при подсчете эритроцитов являются:
•Неточное взятие крови в пипетку.
•Образование сгустка, поглощающего часть клеток и занижающего результат исследования.
•Недостаточное перемешивание содержимого пробирки перед заполнением камеры.
•Неправильная подготовка камеры: недостаточное притирание покровных стекол; неравномерное заполнение камеры, образование пузырьков воздуха.
•Подсчет эритроцитов сразу после заполнения камеры, не выжидая 1 минуту.
•Подсчет меньшего, чем требуется по методике, количества квадратов.
•Плохо вымытые камера, пробирки, пипетка, капилляр для взятия крови; недостаточно просушенные пробирки и пипетки.
• Использование недоброкачественного разводящего раствора. (Луговская и др., 2001)
2.2 Метод подсчета количества лейкоцитов.
Определение количества лейкоцитов в счетной камере: Подсчет лейкоцитов под микроскопом проводят после лизирования эритроцитов в 100 больших квадратах счетной сетки и пересчитывают на 1 л крови, исходя из объема квадратов и разведения крови. Подсчет лейкоцитов должен быть произведен в течение 2-4 ч после взятия крови.
Реактивы: 3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими каплями раствора метиленового синего (для окраски ядер лейкоцитов). Раствор голубого цвета, длительно годен к употреблению.
Ход определения: В пробирку с 0,4 мл уксусной кислоты набирают из пальца 20 мкл крови (разведение 1:20). Можно использовать стабилизированную антикоагулянтом венозную кровь. Выдувают кровь из пипетки на дно пробирки, затем тщательно перемешивают, повторно ее набирая и выдувая. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания лейкоцитов). Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах с малым увеличением (окуляр 10х, объектив 8х). Для большей точности счет лейкоцитов проводят по всей сетке в больших квадратах (неразделенных на малые квадраты и полосы), начиная с левого верхнего угла сетки. Для лучшего контрастирования затемняют поле зрения, опуская конденсор и закрывая диафрагму.
Расчет числа лейкоцитов проводят по формуле:
где Х — число лейкоцитов в 1 мкл крови, а - число лейкоцитов в 100 больших квадратах, 20 — разведение крови, 100- число подсчитанных квадратов, 250 —объем одного большого квадрата 1/250.
Таким образом, количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах, умножают на 50.
При наличии в периферической крови ядросодержащих клеток красного ряд, они не лизируются и подсчитываются вместе с лейкоцитами. В этом случае, чтобы определить истинное количество лейкоцитов, из общего числа посчитанных клеток вычитают количество клеток красного ряда.
Например: Общее количество лейкоцитов при подсчете в камере (или на анализаторе) – 45*109/л. При подсчете лейкоцитарной формулы найдено, что на 100 лейкоцитов присутствует 50 эритробластов (нормобластов).
Рассчитываем истинное количество лейкоцитов в крови:
150 клеток (общее количество - 45*109/л (количество клеток в 1 мкл, лейкоцитов и нормобластов, полученное при подсчете в камере полученное при подсчете или на анализаторе)
лейкоцитарной формулы)
100 клеток (лейкоциты) - Х (истинный лейкоцитоз крови)
Таким образом, истинное число лейкоцитов в крови составляет 30 * 109/л.
Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:
• Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятые в пробирку.
• Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к занижению результата).
•Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис
лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.
•Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов, камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.
•Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева. Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа. (Луговская и др., 2002)
2.3 Методы подсчета количества тромбоцитов.
Для определения количества тромбоцитов используют следующие методы: подсчет в счет ной камере, мазках крови и гематологическом анализаторе. Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки.
Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо контрастированными элементами. Недостаток метода в необходимости подсчета тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови.
Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода - необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его - возможность исследования тромбоцитов в любое время, независимо от момента взятия крови.
Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний объем и распределение по объему. (Луговская и др., 2002)
Метод подсчета в камере.
Принцип: Определение количества тромбоцитов в 1 л крови с учетом ее разведения и объема квадрата счетной сетки камеры Горяева с применением фазово-контрастного устройства для контрастирования тромбоцитов.
Реактивы: Применяют 1% раствор оксалата аммония, который быстро и полностью лизирует эритроциты. Раствор кипятят и фильтруют. Хранят в холодильнике.
Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз; для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реактива и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 25-ЗО мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную камеру. Перемешивают разведенную кровь и заполняют камеру: подносят каплю крови с помощью стеклянной палочки или пастеровской пипетки к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно без пузырьков воздуха заполняла всю поверхность сетки, не затекая в бороздки. Помещают счетную камеру во влажную камеру на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное устройство в соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Тромбоциты считают в 25 больших квадратах.
Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломляющих свет образований.
Расчет тромбоцитов проводят по формуле:
,
где Х - число тромбоцитов в 1 мкл крови; а - число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах, 200 - разведение крови, 25 - число сосчитанных квадратов, 250 - объем одного большого квадрата 1/250 мкл. Число подсчитанных тромбоцитов умножают на 2000.
Воспроизводимость. Ошибка метода составляет 6,5%. (Клиническая лабораторная аналитика, 1999)
Метод подсчета в мазках крови (по Фонио).
Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.
Реактивы: Применяют 14% раствор сульфата магния или 6% раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).
Ход определения: Реактив набирают в капилляр Панченкова до метки “75 и вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки “0”. Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 2-3 ч (при использовании раствора сульфата магния) и в течение 30-45 мин (при приме нении ЭДТА). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены разрозненно).
Реферат опубликован: 18/04/2005 (8460 прочтено)