Страница: 5/7
Гемоглобин – одно из наиболее хорошо изученных белков. Десятки лет исследований гемоглобина в описании и понимании физических, химических и биологических аспектов его функционирования. Огромный вклад внесли работы Макса Перутца и его сотрудников в Кавендишской лаборатории (Кембридж, Великобритания). Однако важность этих работ касается не только гемоглобина. Они послужили основой развития современных представлений о механизмах ферментативного катализа, связав непосредственно кинетику и термодинамику биохимических реакций с динамикой конформационных изменений макромолекул белка. Если отвлечься от непосредственной практической пользы полученных результатов для медицины, фармакологии, то фундаментальное значение работ по изучению механизма функционирования гемоглобина заключается в стимулировании прогресса в установлении законов протекания важнейших процессов: ферментативного катализа и внутриклеточной трансформации энергии в биологических системах. [2]
Об участии гемоглобина в мембранной организации эритроцитов свидетельствует феномен образования серповидной и других форм эритроцитов при различных гемоглобинопатиях, первооснову которого и составляет аномальное взаимодействие эритроцитарной мембраны с мутантными гемоглобинами. Не исключено, что изменение упруго-механических свойств эритроцитарных мемран при повышении отрицательного заряда их внешней поверхности происходит вследствие улучшения условий для создания и структурирования белкового слоя, формируемого с участием гемоглобина на внутренней поверхности эритроцитарных мембран. [13]
Показано, что при получении безгемоглобиновых теней эритроцитов в препаратах электронно-микроскопически обнаруживается большое количество везикул диаметром примерно 100 нм, что свидетельствует о частичной фрагментации плазматической мембраны эритроцитов. В то же время если в мембранах содержится много гемоглобина и других белков, обнаруживаемых в примембранных слоях, то фрагментации мембраны определяемой таким образом, не наблюдается. Имеются и другие доказательства стабилизирующего действия гемоглобина на эритроцитарные мембраны. Например, S.Knutton и соавторам удалось получить две фракции эритроцитарных мембран, различающихся содержанием связанного с ними гемоглобина. Ими было показано, что во фракции эритроцитарных мембран с большим содержанием гемоглобина разрушение липопротеиновой структуры мембран при их дегидротации происходит намного слабее, чем в случае с фракцией эритроцитарных мембран с малым содержанием гемоглобина. В основе изменения условий для структурирования белково-образующего примембранного слоя внутри эритроцитов может лежать изменение электрических поверхностных свойств на внешней стороне. Это возможно вследствие того, что для мембран в липидной зоне дебаевский радиус экранировки зарядов гораздо больше ее толщины, в результате поверхностные заряды с обеих сторон эритроцитарных мембран взаимно влияют друг на друга, образуя самосогласованную систему. Кроме того, условия для образования белкового слоя, стабилизирующего мембраны эритроцитов, могут изменяться и в результате защелачивания их внутренней среды, что имеет место при суспендировании эритроцитов в щелочной или неэлектролитной среде, например, сахарозной. Это может способствовать гемоглобину и другим примембранным белкам за счет изменения их свойств образовывать прочный примембранный белковый слой (в отношении гемоглобина, например, известно, что его свойства, в том числе кислородосвязывающие, сильно изменяются при варьировании рН). Вместе с тем защелачивание внутренней среды эритроцитов не всегда может служить фактором, стабилизирующим их структуру. В литературе, например, утверждают, что для эритроцитов новорожденного теленка, для которых характерно наличие фетального гемоглобина, любые экспериментальные манипуляции, результатом которых является внутриклеточное защелачивание среды, вызывают их самопроизвольный гемолиз. По мере развития организма теленка (2-3 месяца жизни) эритроциты с нормальным гемоглобином, появляющиеся взамен вытесняемых из кровеносного русла клеток, содержащих фетальный гемоглобин, становятся устойчивыми к внутриклеточному защелачиванию их среды. При этом важно отметить, что, по данным литературы, в гемолизе фетальных эритроцитов при защелачивании их внутренней среды, помимо фетального гемоглобина, определенная роль принадлежит и мембранному белку band III. [13]
Приведенные литературные данные дают основание сделать вывод о тесной взаимосвязи процессов метаболизма, трансмембранного транспорта, изменений формы и механических свойств эритроцита, что, по-видимому, позволяет организму осуществлять координированную регуляцию функционирования клетки через соответствующие рецепторные структуры, имеющиеся на наружной поверхности мембраны. [9]
Таким образом, в поддержании структурной целостности эритроцитов важное значение имеют внутренние примембранные белковые слои, структура и взаимодействие которых с эритроцитарными мембранами взаимно обусловлены и в целом представляют собой единую структурную организацию. Поэтому всякая модификация как самой мембраны, так и содержащегося в них гемоглобина в конечном счете сопровождается и модификацией этой особой организации, частным примером проявления которой может быть изменение ее механических свойств. [13] Приведенные данные побудили нас провести исследование с целью оценки количественного содержания мембрансвязанного гемоглобина эритроцитов человека и его связи со структурными белками.
материал и методы исследования
Материал исследования
Материалом настоящего исследования послужили эритроциты 124 практически здоровых лиц, проживающих в городе Курске, в возрасте от 18 до 47 лет. Набор добровольцев проводился при исключении любой соматопатологии.
У обследуемых проводился забор крови из локтевой вены в сухую стерильную посуду в количестве 5-7 мл с целью получения образов эритроцитарных мембран.
Методы исследования
Для достижения поставленной цели и решения задач настоящей работы использовался комплекс методов.
Биохимические методы.
Реактивы и биоматериалы. В работе использовались: декстран Т-500 фирмы "SIGMA" (США), HBS – целлюлоза фирмы "SIGMA" (США), гидрофосфат натрия, хлористый натрий, мочевина фирмы "Bio-Rad" (США), трис, 2 – меркаптоэтанол, персульфат аммония "Reanal" (Венгрия), додецилсульфат натрия (ДДС) фирмы "Диа-Фарм" (Россия), акриламид "SIGMA" (США), N,N¢ - метилен бисакриламид "FLUKA" (Швейцария), кумасси G – 250 фирмы "Serva" (ФРГ), бромфеноловый синий, ТЕМЕД, глицин, набор белков для определения молекулярного веса MS-2 (Россия).
Реактивы отечественного производства были марки "ХЧ" и "ОСЧ".
Получение эритроцитов. Эритроциты получали из 5 мл гепаринизированной крови по методу Бейтлера с незначительной модификацией. [14] Сначала гепаринизированную кровь отстаивали дважды в растворе PBS, содержащем 3% декстран Т –500, в течение 30 минут. Затем эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке, пропуская ее через колонку с HBS-целлюлозой, после чего эритроциты ценрифугировали при 3000 оборотах в минуту. Далее из полученной очищенной массы эритроцитов проводили выделение мембран.
Выделение мембран. Для получения препаратов мембран эритроциты разрушали осмотическим шоком по методу Dodge с небольшой модификацией, заключавшейся в том, что гемолиз эритроцитов и отмывку "теней" проводили двукратно в 10 мМ Na – фосфатном буфере с добавлением ингибитора протеназ PMSF. После этого мембраны эритроцитов лиофилизировали и хранили при -20°С.
Одномерный электрофорез по Лэммли. Электрофорез в присутствии ДДС проводили модифицированным методом методом Лэммли. [14] Для этой цели использовали следующие растворы:
60% акриламид –0,8% метилен бисакриламид.
Буфер для разделяющего геля: 1 М трис – HCI (pH 8,8).
Буфер для концентрирующего геля: 0,5 М трис – HCI (pH 6,8).
10% додецилсульфат натрия.
10% персульфат аммония.
ТЕМЕД.
Электродный буфер для ЭФ: 0,025М трис, 0,193М глицин, 0,1% додецилсульфат натрия.
Растворы хранились при +4°С две-три недели. Раствор 5 готовился перед использованием.
Электрофорез проводили в пластинах ПААГ размером 180х180х1мм, приготовленных с линейным градиентом концентрации акриламида 5 - 25%.
Для приготовления одной пластины ПААГ брали: 0,85 мл раствора 1, 5,5 мл дистиллированной воды, 3,6 мл раствора 2, 101 мкл раствора 4, 5 мкл раствора 6 и 20 мкл раствора 5 (легкий раствор, 5%). В тяжелом (25%) растворе в отличие от легкого бралось 4,2 мл раствора 1 и 2,6 мл дистиллированной воды. Через смеситель эти растворы подавались перистальтическим насосом в формирователь пластины, в течение 10 минут заполняя пластину на 4 см ниже верхнего края. Сверху на полимеризующуюся смесь наслаивалось 0,5 мл дистиллированной воды. Так формировался разделяющий гель. Полимеризация продолжалась в течение 30-40 минут. После полимеризации воду удаляли и заливали раствор, формирующий концентрирующий гель. Для приготовления такого раствора брали 660 мкл раствора 1, 100 мкл раствора 4, 2,5 мл раствора 3, 4 мкл раствора 6, 70 мкл раствора 5 и 6 мл дистиллированной воды. Вставляли формирователь лунок и наслаивали 0,3 мл дистиллированной воды. Полимеризация продолжалась в течение 20 минут, после чего пластины ПААГ могли храниться при =4°С в течение двух суток.
Реферат опубликован: 8/04/2005 (16815 прочтено)