Страница: 10/33
Гемолитическую систему готовили следующим образом. К стандартизованной 5 % взвеси эритроцитов барана медленно, при постоянном помешивании, добавляли равный объем гемолизина в тройном титре. Так, если полный гемолиз наблюдался в пробирке с разведением гемолитической сыворотки 1:1200, то для приготовления гемолитической системы брали разведение 1:400 (0,1 мл цельной гемолитической сыворотки и 39,9 мл буфера). Пробирки с гемолитической системой встряхивали и инкубировали при 37° С в течение 1ч для сенсибилизации эритроцитов барана.
Исследуемую сыворотку, разводили 1:10, разливали в 10 пробирок и доводили буферным раствором (физиологическим) до 1,0 мл. После этого в каждую пробирку добавляли 1 мл гемолитической системы, то есть сенсибилизированных эритроцитов барана, 2-я пробирка — контрольная.
|
Исследуемая сыворотка (1:10), мл |
0,05 |
0,1 |
0,15 |
0,2 |
0,25 |
0,3 |
0,35 |
0,4 |
0,45 |
0,5 |
|
Буферный раствор |
0,95 |
0,9 |
0,85 |
0,8 |
0,75 |
0,7 |
0,65 |
0,6 |
0,55 |
0,5 |
|
Сенсибилизированные эритроциты барана |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
Пробирки инкубировали при 37° С в течение 45 мин, охлаждали в холодильнике 10 мин, центрифугировали при 1500 об/мин и колориметрировали на ФЭК в кюветах (10мм) с зеленым светофильтром против воды и определяли процент гемолиза.
Для определения активности комплимента в гемолитических единицах готовили шкалу и кривую гемолиза. Для приготовления шкалы гемолиза к 1 мл стандартной 5 % взвеси эритроцитов барана прибавляли 3 мл дистиллированной воды в результате чего происходил гипотонический лизис эритроцитов (100 % гемолиз). Пробирку центрифугировали (при 1500 об/мин 10 мин) и готовили шкалу гемолиза:
|
100 % гемолиз эритроцитов на дистиллированной воде |
0,1 |
0,2 |
0,3 |
0,4 |
0,5 |
0,6 |
0,7 |
0,8 |
0,9 |
1,0 |
|
Буферный раствор, мл |
0,9 |
0,8 |
0,7 |
0,6 |
0,5 |
0,4 |
0,3 |
0,2 |
0,1 |
0 |
|
Гемолиз, % |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
Реферат опубликован: 18/04/2005 (70465 прочтено)