Страница: 22/52
дает применение протеиназы-К с последующей фенол - хлоро-
формной экстракцией разрушенных белков. ДНК осаждают в эта-
ноле и растворяют в буферном растворе. Оценку качества экс-
трагированной ДНК проводят на основании измерения оптической
плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового
спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение
А(260)/A(280) > 1.8. В противном случае процедуру очистки
необходимо повторять, так как для успешного использования и
хранения ДНK белки должны быть полностью удалены. Более под-
робно с методами выделения и очистки ДНК из различных тканей
можно ознакомиться в работах и руководствах, приведенных в
конце книги (Маниатис и др., 1984; Дейвис, 1990; Горбунова и
др., 1991).
В процессе сложного и многообразного функционирования
различные участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные
регулируемые и, в основе своей, обратимые изменения. Эти мо-
дификации осуществляются с помощью специальных белков - фер-
ментов. Описание ферментативного аппарата репликации, транс-
крипции, репарации - системы защиты и восстановления повреж-
денных участков ДНК, рекомбинации, то есть обмена участками
гомологичных хромосом и ДНК, далеко выходит за рамки нашего
изложения. Мы кратко ознакомимся только с двумя классами
ферментов ДНК - полимеразами и рестриктазами, особенно важ-
ными для понимания основ современной молекулярной диагности-
ки.
Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК-по-
лимеразами. И в бактериальных клетках, и в клетках эукариот
содержатся три различные формы ДНК-полимераз, все они обла-
дают синтезирующей активностью и способны удлинять цепи ДНК
в направлении 5' - 3', последовательно наращивая по одному
нуклеотиду к 3'-OH концу, причем точность синтеза определя-
ется специфичностью спаривания оснований. Таким образом, для
работы ДНК-полимеразы необходима однонитевая матричная ДНК с
двухнитевым участком на 3'- конце молекулы. Кроме того, в
среде должны присутствовать четыре типа трифосфатов (dATP,
dCTP, dGTP и dTTP) - молекул, состоящих из основания -A,C,G
или T, сахара - дезоксирибозы (d) и трех фосфатных остатков
(P). В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК-полиме-
раза альфа, а в клетках E. coli - ДНК-полимераза 111.
ДНК-полимеразы обладают различными активностями, в том числе
и экзонуклеазной в направлении 3' - 5', что позволяет им
исправлять - репарировать, дефекты, допущенные при подборе
комплементарных оснований. ДНК-полимераза 1 E. coli способна
инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомо-
логичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство использу-
ется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом
ник-трансляции.
Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонукле-
азной активностью - рестрикционных эндонуклеаз или рестрик-
таз, значительно продвинуло исследование структуры ДНК и
возможности генноинженерного манипулирования с молекулами
ДНК. In vivo эти ферменты участвуют в системе распознования
и защиты "своих" и уничтожении чужеродных ДНК. Рестриктазы
узнают специфические последовательности из 4 - 6, реже 8 -
12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезают ее
на фрагменты в местах локализации этих последовательностей,
называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рест-
рикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемос-
ти сайтов рестрикции, а их размер - характером распределения
этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще распо-
ложены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после
рестрикции. В настоящее время известно более 500 различных
типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый
из этих ферметов узнает свою специфическую последователь-
ность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из
различных видов бактерий и обозначают тремя буквами, соот-
ветствующими первым трем буквам латинского названия вида
бактерий, и римской цифрой, соответствующей хронологии отк-
рытия этого фермента у данного вида бактерий. В зависимости
от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК
различают три класса рестриктаз часто-, средне- и редкощепя-
щие. Естественно, что рестриктазы, узнающие длинные специфи-
ческие последовательности (8-12 п.о.), как правило, являются
редкощепящими (например Nor1), а узнающие короткие (4-5
п.о.) - частощепящими (Taq1, EcoR1).
Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве
генетических маркеров ДНК. Действительно, образующиеся в ре-
зультатае рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по
длине путем электрофореза в агарозном или полиакриломидном
геле, и тем самым может быть определена их молекулярная мас-
са, а, значит, и физическое расстояние между сайтами. Напом-
ним, что обычным методом выявления ДНК в геле, также как и
РНК, является ее специфическое окрашивание, чаще всего эти-
диумом бромидом, и просмотр геля в проходящем ультрофиолете.
При этих условиях места локализации ДНК имеют красную окрас-
ку. При использовании для рестрикции нескольких эндонуклеаз
с последующим электрофоретическим анализом перекрывающихся
аддитивных по длине фрагментов ДНК можно добиться полного
упорядочивания сайтов узнавания для каждого из ферментов от-
носительно друг друга и каких-то иных маркеров, присутствую-
щих в исследуемой молекуле ДНК. Процесс этот называется фи-
зическим картированием и является обязательным элементом
анализа плазмидных, вирусных, бактериальных ДНК и относи-
тельно небольших фрагментов ДНК эукариот. На рис.1.2. предс-
тавлен простейший пример такого картирования в том случае,
когда в исследуемой молекуле ДНК присутствует по одному сай-
ту рестрикции для двух эндонуклеаз. После обработки исходной
ДНК отдельно каждой из рестриктаз образуется два фрагмента,
соответствующих по длине расстоянию от концов молекулы ДНК
до сайтов рестрикции. При совместной обработке обеими эндо-
нуклеазами на электрофореграмме появляется новый фрагмент,
размер которого соответствует расстоянию между сайтами рест-
рикции. Очевидно, что эти данные еще не позволяют однозначно
определить положение сайтов рестрикции по отношению к концам
молекулы ДНК. Однако, достаточно знать расположение хотя бы
одного маркера для того, чтобы произвести точное физическое
картирование исходной молекулы ДНК независимо от количества
локализованных в ней сайтов рестрикции.
При обработке тотальной геномной эукариотической ДНК, в
частности ДНК человека, часто- или среднещепящими эндонукле-
азами образуется так много фрагментов различной длины (в
среднем, порядка 1 миллиона), что их не удается разделить с
помощью электрофореза, то есть не удается визуально иденти-
фицировать отдельные фрагменты ДНК на электрофореграмме.
После электрофореза рестрцированной геномной ДНК получается
равномерное окрашивание по всей длине геля - так называемый
шмер. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле воз-
можна только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Это
достигается при помощи метода блот-гибридизации по Саузерну.
1.3. Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ.
Одним из наиболее эффективных методов идентификации
определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделен-
ных фрагментов является ставший уже классическим метод
блот-гибридизации по Саузерну, по фамилии автора Edцuard So-
uthern, предложившего данный метод в 1975г . Последователь-
ные этапы данного метода представлены на Рис.1.3. Суть мето-
да заключается в том, что геномная ДНК подвергается рестрик-
ции одной или несколькими рестриктазами, после чего образую-
щиеся фрагменты разделяются по молекулярному весу в агароз-
ном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатура-
ции in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно
нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам пере-
нос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных
сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на филь-
тре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченым ДНК или РНК зон-
дом. Методом авторадиографии определяют положение искомого
фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридиза-
ция - высоко чувствительный метод идентификации специфичес-
ких последовательностей ДНК. При достаточно длительной экс-
позиции (в течение несколько дней) и при высокой удельной
радиоактивности ДНК-зонда (более 10!9 расп/ мин/микроГ) этот
метод позволяет выявлять менее, чем 0,1 пикоГ ДНК. Так при
использовании зонда размерами в несколько сот оснований уни-
кальная последовательность в 1 000 п.о. может быть выявлена
в 10 микроГ геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной
полосы на радиоавтографе после его экспозиции в течение 12
часов. Метод позволяет работать и с очень короткими олиго-
нуклеотидными зондами (20 п.о.), однако требует особенно хо-
рошего мечения и длительной экспозиции фильтра. Необходи-
Реферат опубликован: 26/04/2005 (125954 прочтено)