Страница: 34/52
четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми
повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с
успехом используются для идентификации личности методом
ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у
двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным
локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно
меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR
найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдо-
гена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомоло-
гичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В
последнее время многочисленные VNTR- последовательности об-
наружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).
Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати-
ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с по-
мощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особен-
но удобны для такого скрининга геномные библиотеки,
сконструированные на основе предварительно фракционированных
по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие
фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисате-
литными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие
результаты были получены также при скринировании космидных
библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и
использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР
(Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью
применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага
М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour
etal., 1990).
Одним из вариантов минисателлитных последовательностей
являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы
-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и
также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых
единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы
обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других
частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от
друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20
кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три-
и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как
они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR
обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее
время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих
тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых
частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в
сторону их увеличения может приводить к нарушению функции
этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причи-
ной ряда тяжелых наследственных заболеваний - болезни
экспансии (см.Главу X). В качестве зондов для выявления ко-
ротких тандемных повторов используют синтетические олигонук-
леотиды, построенные из простых повторов трех или четырех
нуклеотидов.
В последнее время для обнаружения различных классов
микросателлитных последовательностей и STR-повторов применя-
ют эффективные методы, основанные на использовании ПЦР
(Edwards et al., 1991). Для этих локусов характерно большое
число аллелей, которые различаются по числу коровых единиц.
Продукты амплификации этих сайтов могут отличаться друг от
друга числом ди- три- или тетрануклеотидных повторов. Для
удобства идентификации различных аллелей полимеразную цепную
реакцию проводят в присутствии меченых нуклеотидов, а для
электрофоретического разделения продуктов амплификации
используют специальные секвенирующие гели. Многие STR-локусы
настолько полиморфны, что нашли применение в судебной меди-
цине для идентификации личности. Для повышения достоверности
результатов с этой целью используют мультиплексные варианты
ПЦР, позволяющие устанавливать генотип индивидуума одновре-
менно по нескольким STR-сайтам (Weber,May, 1994; Асеев и
др.,1995). Возможность точного генотипирования личности с
использованием полимеразной цепной реакции, то есть на мини-
мальном количестве ДНК, является важным методическим преиму-
ществом STR перед ранее рассмотренными VNTR, для анализа ко-
торых чаще используют блот-гибридизацию по Саузерну.
Высокая частота коротких тандемных повторов, уникаль-
ность комбинаций числа тетра-, три- и димеров в разных сай-
тах в сочетании с их большой вариабильностью и сравнительной
легкостью идентификации аллелей позволяет широко использо-
вать эти повторы для генетического и физического картирова-
ния в качестве наиболее удобных индексных маркеров геномных
ДНК-последовательностей (см.Главу III). Такие маркерные сай-
ты получили название STS (sequence tagged sites). В настоя-
щее время в геноме человека уже идентифицировано около 10
000 STS, подавляющее большинство которых представляет собой
тандемные повторы 2 - 4 нуклеотидов. Благодаря выраженной
индивидуальной специфичности и достаточно стабильному менде-
левскому типу наследования STS-сайты нашли широкое примене-
ние и в молекулярной диагностике генных болезней, прежде
всего в качестве молекулярных маркеров для идентификации му-
тантных хромосом в семьях высокого риска (см. Главу VII).
Наличие большого числа гипервариабильных микро- и минисател-
литных последовательностей ДНК является характерной особен-
ностью генома человека. Аналогичные последовательности, об-
наруженные в геноме приматов, значительно более однородны,
что доказывает возможность существенного увеличения вариа-
бильности этих участков ДНК за сравнительно короткий эволю-
ционный промежуток (Юров,1988; Gray et al., 1991).
Сведения о мутабильности высокополиморфных последова-
тельностей в геноме человека весьма противоречивы. Показано,
однако, что в наиболее вариабильных минисателлитных локусах
частота мутаций может достигать 5% на гамету (Jeffreys et
al., 1988). Предполагается, что одной из главных функций ги-
первариабильных микро- и минисателлитных последовательностей
ДНК может быть контроль гомологичной рекомбинации в мейозе.
На культурах клеток показано стимулирующее влияние миниса-
теллитных последовательностей ДНК на гомологичную рекомбина-
цию. Так, инсерция синтезированной последовательности,
составленной на основе гипервариабильных минисателлитов в
геномную ДНК приводит к более, чем 10-кратному увеличению
числа реципрокных обменов, причем степень этого влияния об-
ратно пропорциональна расстоянию между STR и сайтом рекомби-
нации (Wahls et al., 1990). Вместе с тем, многие авторы об-
ращают внимание на достаточно высокую стабильность миниса-
теллитных аллелей, что позволяет их широко использовать как
для генетического маркирования, так и для популяционных
исследований и идентификации личности методом ДНК-фингерп-
ринта (Decorte,Cassiman 1993; Edwards et al.,1991; Ива-
нов,1989).
Для многих мутаций, локализованных в некодирующих
частях генома, характерны высокие уровни популяционного по-
лиморфизма. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эта измен-
чивость не затрагивает общей структуры генома, определяющей
различия между видами. Более того, сопосталение первичных
нуклеотидных последовательностей сравнительно протяженных
секвенированных участков ДНК (области Т-рецепторных генов
длиной около 100 кб) обнаружило сохранение высокой степени
гомологии не только в кодирующих, но и, что особенно удиви-
тельно, в некодирующих частях этих последовательностей. Если
учесть, что эволюционно человек и мышь разделены почти 80
миллионами лет эволюции, эти данные рассматриваются как сви-
детельство функциональной значимости некодирующих частей
этих генов По-видимому, далеко не всякие мутации в некодиру-
ющих районах ДНК являются нейтральными и в определенных слу-
чаях они могут отрицательно влиять на жизнеспособность. К
сожалению, в настоящее время ничего или почти ничего неиз-
вестно о функциях некодирующих ДНК-последовательностей.
Высказывалось даже предположение, что их единственной функ-
цией является репликация. Отсюда возникло представление об
"эгоистической" или "паразитической" ДНК. Конечно, полностью
исключить наличие подобных паразитических последователь-
ностей ДНК в любом геноме нельзя. Тем ни менее, представля-
ется маловероятным, что значительная часть генома человека,
также как и других видов, относится к эгоистической ДНК.
По-видимому, наши знания о роли некодирующей или, как еще
говорят, "избыточной" ДНК все еще явно недостаточны. Ста-
бильность структурной организации генома в пределах вида
свидетельствует скорее о важной эволюционной роли некодирую-
щих ДНК-последовательностей и об их участии в процессах он-
тогенеза. Можно предполагать, что ответ на этот интригующий
вопрос в какой-то мере будет получен при расшифровке и срав-
нении полной первичной нуклеотидной последовательности гено-
мов у животных разных видов и, прежде всего, у человека и
мыши, где прогресс в секвенировании геномной ДНК особенно
Реферат опубликован: 26/04/2005 (125555 прочтено)