Страница: 41/52
ной ряда тяжелых наследственных заболеваний - болезни
экспансии (см.Главу X). В качестве зондов для выявления ко-
ротких тандемных повторов используют синтетические олигонук-
леотиды, построенные из простых повторов трех или четырех
нуклеотидов.
В последнее время для обнаружения различных классов
микросателлитных последовательностей и STR-повторов применя-
ют эффективные методы, основанные на использовании ПЦР
(Edwards et al., 1991). Для этих локусов характерно большое
число аллелей, которые различаются по числу коровых единиц.
Продукты амплификации этих сайтов могут отличаться друг от
друга числом ди- три- или тетрануклеотидных повторов. Для
удобства идентификации различных аллелей полимеразную цепную
реакцию проводят в присутствии меченых нуклеотидов, а для
электрофоретического разделения продуктов амплификации
используют специальные секвенирующие гели. Многие STR-локусы
настолько полиморфны, что нашли применение в судебной меди-
цине для идентификации личности. Для повышения достоверности
результатов с этой целью используют мультиплексные варианты
ПЦР, позволяющие устанавливать генотип индивидуума одновре-
менно по нескольким STR-сайтам (Weber,May, 1994; Асеев и
др.,1995). Возможность точного генотипирования личности с
использованием полимеразной цепной реакции, то есть на мини-
мальном количестве ДНК, является важным методическим преиму-
ществом STR перед ранее рассмотренными VNTR, для анализа ко-
торых чаще используют блот-гибридизацию по Саузерну.
Высокая частота коротких тандемных повторов, уникаль-
ность комбинаций числа тетра-, три- и димеров в разных сай-
тах в сочетании с их большой вариабильностью и сравнительной
легкостью идентификации аллелей позволяет широко использо-
вать эти повторы для генетического и физического картирова-
ния в качестве наиболее удобных индексных маркеров геномных
ДНК-последовательностей (см.Главу III). Такие маркерные сай-
ты получили название STS (sequence tagged sites). В настоя-
щее время в геноме человека уже идентифицировано около 10
000 STS, подавляющее большинство которых представляет собой
тандемные повторы 2 - 4 нуклеотидов. Благодаря выраженной
индивидуальной специфичности и достаточно стабильному менде-
левскому типу наследования STS-сайты нашли широкое примене-
ние и в молекулярной диагностике генных болезней, прежде
всего в качестве молекулярных маркеров для идентификации му-
тантных хромосом в семьях высокого риска (см. Главу VII).
Наличие большого числа гипервариабильных микро- и минисател-
литных последовательностей ДНК является характерной особен-
ностью генома человека. Аналогичные последовательности, об-
наруженные в геноме приматов, значительно более однородны,
что доказывает возможность существенного увеличения вариа-
бильности этих участков ДНК за сравнительно короткий эволю-
ционный промежуток (Юров,1988; Gray et al., 1991).
Сведения о мутабильности высокополиморфных последова-
тельностей в геноме человека весьма противоречивы. Показано,
однако, что в наиболее вариабильных минисателлитных локусах
частота мутаций может достигать 5% на гамету (Jeffreys et
al., 1988). Предполагается, что одной из главных функций ги-
первариабильных микро- и минисателлитных последовательностей
ДНК может быть контроль гомологичной рекомбинации в мейозе.
На культурах клеток показано стимулирующее влияние миниса-
теллитных последовательностей ДНК на гомологичную рекомбина-
цию. Так, инсерция синтезированной последовательности,
составленной на основе гипервариабильных минисателлитов в
геномную ДНК приводит к более, чем 10-кратному увеличению
числа реципрокных обменов, причем степень этого влияния об-
ратно пропорциональна расстоянию между STR и сайтом рекомби-
нации (Wahls et al., 1990). Вместе с тем, многие авторы об-
ращают внимание на достаточно высокую стабильность миниса-
теллитных аллелей, что позволяет их широко использовать как
для генетического маркирования, так и для популяционных
исследований и идентификации личности методом ДНК-фингерп-
ринта (Decorte,Cassiman 1993; Edwards et al.,1991; Ива-
нов,1989).
Для многих мутаций, локализованных в некодирующих
частях генома, характерны высокие уровни популяционного по-
лиморфизма. Необходимо, однако, подчеркнуть, что эта измен-
чивость не затрагивает общей структуры генома, определяющей
различия между видами. Более того, сопосталение первичных
нуклеотидных последовательностей сравнительно протяженных
секвенированных участков ДНК (области Т-рецепторных генов
длиной около 100 кб) обнаружило сохранение высокой степени
гомологии не только в кодирующих, но и, что особенно удиви-
тельно, в некодирующих частях этих последовательностей. Если
учесть, что эволюционно человек и мышь разделены почти 80
миллионами лет эволюции, эти данные рассматриваются как сви-
детельство функциональной значимости некодирующих частей
этих генов По-видимому, далеко не всякие мутации в некодиру-
ющих районах ДНК являются нейтральными и в определенных слу-
чаях они могут отрицательно влиять на жизнеспособность. К
сожалению, в настоящее время ничего или почти ничего неиз-
вестно о функциях некодирующих ДНК-последовательностей.
Высказывалось даже предположение, что их единственной функ-
цией является репликация. Отсюда возникло представление об
"эгоистической" или "паразитической" ДНК. Конечно, полностью
исключить наличие подобных паразитических последователь-
ностей ДНК в любом геноме нельзя. Тем ни менее, представля-
ется маловероятным, что значительная часть генома человека,
также как и других видов, относится к эгоистической ДНК.
По-видимому, наши знания о роли некодирующей или, как еще
говорят, "избыточной" ДНК все еще явно недостаточны. Ста-
бильность структурной организации генома в пределах вида
свидетельствует скорее о важной эволюционной роли некодирую-
щих ДНК-последовательностей и об их участии в процессах он-
тогенеза. Можно предполагать, что ответ на этот интригующий
вопрос в какой-то мере будет получен при расшифровке и срав-
нении полной первичной нуклеотидной последовательности гено-
мов у животных разных видов и, прежде всего, у человека и
мыши, где прогресс в секвенировании геномной ДНК особенно
значителен (см.Главу III). Уместно заметить, что проведенный
недавно компьютерный анализ генома человека позволяет пред-
полагать наличие в его некодирующей части особого, пока еще
непонятного генетического кода, смысл и значение которого
остаются загадочными ( ?).
Раздел 2.7 Мобильность генома, облигатные и факульта-
тивные элементы генома.
До сих пор мы рассматривали основные структурные эле-
менты генома человека, положение которых в соответствии с
представлениями классической генетики достаточно постоянно.
Начиная с 50-х годов стали накапливаться данные о существо-
вании большого числа мобильных генетических элементов,
присутствие которых в геноме не является обязательным, а их
топография и количество может варьировать в различных клет-
ках, тканях и у разных индивидуумов (McClintock, 1984; Berg,
Howe, 1989). У прокариот такие элементы получили название
транспозонов. Их структура и функции достаточно хорошо изу-
чены. Отличительной особенностью мобильных элементов явля-
ется способность существовать как в интегрированном с хро-
мосомой виде, так и в виде отдельных макромолекул - эписом,
плазмид, вирусных частиц. Почти 50 различных семейств мо-
бильных элементов описано у дрозофилы . Вместе эти последо-
вательности составляют около 12% гаплоидного набора
(Golubovsky, 1995). В геноме млекопитающих содержится до 50
000 диспергированных копий ретропозона LINE размером около
6500 пар основанийю. Семейство Alu- повторов, содержащее от
300 до 500 тысяч копий, также относится к числу мобильных
элементов генома (Сharlesworth et al.,1994). Явление лизоге-
нии, то есть присутствие вирусных последовательностей в
составе ДНК человека и наличие фрагментов генов человека в
вирусных геномах, служит одним из примеров мобильности ДНК и
возможности "горизонтальной" передачи наследственно закреп-
ленных признаков между видами. Мобильные ДНК, как правило,
относятся к факультативным элементам. Как уже отмечалось, не
существует четких границ между облигатными и факультативными
элементами генома, так как возможен взаимный переход от од-
ного состояния к другому. Структурные локусы или сегменты
хромосом могут трансформироваться в факультативные элементы
за счет амплификации, интеграции в мобильные элементы или
путем образования цитоплазматических ретротранскриптов. Об-
ратный переход от факультативных элементов к облигатным осу-
ществляется посредством инсерций, транспозон-индуцированных
перестроек и обратной транскрипции.
Факультативные элементы существуют в геноме как популя-
ции информативных макромолекул. Изменения, возникающие в них
Реферат опубликован: 26/04/2005 (125943 прочтено)