Страница: 3/8
1Результат: 0 - "зонтик" (реакция агглютинации есть, АТ нет
- "пуговка" (РА нет, АТ есть
Последняя ячейка с положительной пробой ("пуговкой") означа-
ет титр АТ.
б) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у
больного по выделенной культуре
1Постановка реакции:
3 ряда лунок в иммунологической планшете:
│Антисыворотка к вирусу гриппа типа А --- раститровка
│Антисыворотка к вирусу гриппа типа В --- раститровка
│Антисыворотка к вирусу гриппа типа С --- раститровка
│+ Вирус-содержащий материал от больного (культура, но-
│ совая жидкость) во все 3 ряда
│ (Или наоборот, раститровка в 3 рядах вирусов + АТ,
│ если нужно сориентироваться в количестве вирусов)
│+ эритроциты любого вида животного
1Результат: 0 - ряд с "пуговками" означает тип вируса.
5- Сыворотку титруют (1/10-1/2560) - 0,25мл;
5- добавляется вирус в четырехкратном титре (разведение в 4
5раза от исходного титра)
5- инкубируют 30 минут при 37оС
5- добавляют 0,5мл 1-2% взвеси эритроцитов
5- инкубируют 30 минут при 37оС или 45 минут при комнатной
5температуре.
в) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у
больного по наличию антител в сыворотке крови
1Постановка реакции:
3 ряда лунок в иммунологической планшете:
│Сыворотка больного --- раститровка в 3 рядах
│+ Музейный вирус типа А (в первый ряд)
│+ Музейный вирус типа В (во второй ряд)
│+ Музейный вирус типа С (в третий ряд)
│+ эритроциты любого вида животного
1Результат: 0 - ряд с наибольшим количеством "пуговок" означает
наибольший титр АТ у больного к данному типу
вируса, что предположительно говорит о соот-
ветствующем гриппе (для доказательства оценива-
ют титр АТ в динамике с интервалом в 2 недели;
при увеличении титра минимум в 4 раза можно го-
ворить об острой инфекции и соответствующем за-
болевании).
3РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ
Реакции иммобилизации основаны на способности специфических
АТ, циркулирующих в сыворотке больных, подавлять подвижность
различных микроорганизмов.
На практике нашли применение реакции иммобилизации бледной
трепонемы и холерного вибриона.
3РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП)
- реакции взаимодействия между антигеном и антисывороткой с
образованием видимого "осадка" (преципитата) - преципитирующих
иммунных комплексов (ПИК). 5МАТ (моноклональные АТ) одновалент-
5ные, поэтому в РП пока не используются. 0
┌───────────────── РП ────────────────────┐
_В жидкой фазе . _В агарозе . (1%)
- реакции кольце- - в т.ч. электрофоретические
преципитации (в этом случае агароза варится
- нефелометрия на веронал-мединаловом буфере
(ВМБ, рН 8,6)
Механизм взаимодействия антигенов и антител:
АГ │ АГ=АТ │ АТ
(пропорциональное
количество АГ и АТ;1:1)
│ │ │ │ │ │ │
│ │
┌───┐ о о │ / \ / \ / \ / \ / \│ Y Y ┌───┐
│АГ │ о о │ о о о о о │ Y Y │АТ │
└───┘ 7 0 о │ \ / \ / \ / \ / \ /│ Y └───┘
о о │ │ │ │ │ │ │ Y
ПИК
(преципитирующие ИК,
преципитат)
1) _ 2Реакция кольцепреципитации
│─│
│ │- АГ
│ │
│=│- зона преципитации (помутнения) в пробирке или капилляре
│ │
│ │ - Антисыворотка
└─┘
а) _Определение С-реактивного белка . (СРБ): капилляр наполови-
ну заполняют антисывороткой к СРБ и дополняют сывороткой боль-
ного. Капилляр вставляют в пластелиновую пробку и оставляют до
утра. Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии
СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности
деструктивных процессов в организме).
5Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-
5не 0ц 5 треть - исследуемой сывороткой. Капилляр покачивают 12-15
5раз для смешивания ингредиентов и устанавливают вертикально на
5пластилиновый штатив. оставляют 24 часа при комнатной темпера-
5туре. Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии
5СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности
5деструктивных процессов в организме).
5Результат оценивают по высоте преципитата в капилляре.
б) _Диагностика сибирской язвы
Прокипяченый инфицированный материал
+ антисыворотка (медленно наносить; по стенке пробирки сте-
кает под слой АГ)
Инкубация несколько минут. Зона помутнения свидетельствует о
присутствии АГ в материале.
2) _ 2Нефелометрические, тербидиметрические методы
Принцип нефелометрии заключается в измерении количества све-
та, рассеиваемого частицами (ПИК) в жидкой среде. Для нефело-
метри оптимальны растворы низкой концентрации (в отличие от
турбидиметрии, для которой оптимальны растворы высокой концент-
рации, поскольку в этом случае измеряется потеря проходящего
света).
5Чувствительность метода - 100 мкг/мл антител или антигена
5при исследовании цельной сыворотки и 1 мкг/мл при исследовании
5чистых растворов. Данным методом можно проводить до 120 анали-
5зов в час. Время образования ИК можно значительно сократить,
5если ее проводить в 4% полиэтиленгликоле с М. 6000Д.
3) _ 2Метод преципитации в геле по Оухтерлоню
Стекла или чашки Петри заливают 1-2% агаром или агарозой.
После застывания агара вырезают по трафарету лунки. В одни лун-
ки вносят исследуемые сыворотки (препараты), в другие, располо-
женные напротив - соответствующие антисыворотки. Пластины инку-
бируют во влажной камере в течение 24-48 часов.
Варианты постановки:
- 2 лунки (диаметром 3-5 мм) на расстоянии 3-5 мм друг от
друга (одна с АТ, другая с АГ);
- в центре лунка с антисывороткой, вокруг лунки с разными
пробами АГ-содержащего материала (или наоборот, в центре - АГ,
по периферии - АТ);
- бороздка (или полоска пропитанной фильтровальной бумагой,
наложенной на агарозу) с антисывороткой (АТ-ми), по бокам лунки
с АГ или бляшки микробов, синтезирующих токсин (определение
токсигенности дифтерийной палочки).
4) _ 2Метод преципитации в геле по Манчини
_ 2(метод радиальной иммунодиффузии - РИД)
/ \---- зона преципитации
│ о--│---- лунка с точно дозированным количеством
\ 4--- 0/ сыворотки
Метод количественного определения антигенов основан на изме-
рении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении
исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в кото-
ром предварительно диспергирована моноспецифическая антисыво-
ротка. В слое агара пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм
на расстоянии 15мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят
с помощью микрошприца по 2мкл антигена (или стандартной сыво-
ротки) в разведениях 1/1, 1/2, 1/4, 1/8. Лунки следующих рядов
заполняются испытуемыми препаратами. Пластины инкубируют во
влажной камере в течение 24 часов (пластины с анти-Ig M сыво-
роткой - 48 часов). По окончании инкубации измеряют диаметры
колец преципитации. Концентрацию антигена определяют по калиб-
ровочной кривой.
Например, определение концентрации Ig M,G,A в сыворотке кро-
ви больных.
5) _ 2Ракетный электрофорез 0 2(электроиммунодиффузия)
1/4 о=== о - лунки с точно дизированным
1/2 о====== количеством сыворотки
1/1 о========== === - зоны преципитации
2- + 0 (измеряется длина зон, мм)
Катод Анод
1/1, 1/2, 1/4 - разведения стандартной сыворотки (т.е.
сыворотки с известным количеством антител)
Ставятся для построения калибровочной кривой.
В 1966г. Laurell разработал метод, сочетающий иммунодиффузию
с электрофорезом. Антиген движется в геле агарозы, содержащем
антисыворотку. Для электрофоретических реакций преципитации
агарозу расплавляют в веронал-мединаловом буфере (рН 8,6) в во-
дяной бане, остужают до 52 5о 0С, смешивают с антисывороткой и за-
ливают на стекло.
После застывания (через 5 минут) вдоль кромки слоя геля де-
лают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал. В слое
геля создают электрическое поле, благодаря которому антиген
входит в гель. Зона преципитации приобретает вид "ракеток". Вы-
сота "ракеты", образующейся в результате реакции, прямо пропор-
циональна концентрации антигена (она измеряется от верхней гра-
ницы лунки до высоты пика).
6) _ 2Противоточный или встречный электрофорез . 0 (экспресс-диаг-
Реферат опубликован: 15/06/2005 (23788 прочтено)