Страница: 6/8
б) in vivo
1- 0Например, определение типа токсина Clostridium botulinum
при ботулизме. Клостридии ботулизма способны продуцировать 7
серотипов токсина - А,В,С,D,E,G,F, из которых в нашей стране
встречаются чаще токсин типа А, типа В и типа Е.
Допустим, человек отравился токсином Е:
│ │ │ │ │ │
│ │ │ │ │ РН│
├───┤ ├───┤ ├───┤
│ Е │ │ Е │ │ 2Е 0 │
└───┘ └───┘ └───┘
+ АТ к А + АТ к В + АТ к 2Е
│ │ │
мышь погибнет мышь погибнет мышь выживет
Токсин-содержащий материал разливают по 3 пробиркам и добав-
ляют в первую - антисыворотку к токсину А,
во вторую - антисыворотку к токсину В,
в третью - антисыворотку к токсину Е.
В 3 пробирке произойдет образование ИК, т.е. нейтрализация ток-
сина (РН). Для выявления данной пробирки содержимое вводят трем
мышкам. Третья мышь выживет.
1Минимальной летальной дозой токсина 0 считается количество
токсина. которое при подкожном введении морской свинке весом
250г вызывает ее гибель в течение 4-5 дней.
4) Феномен гашения сыпи (in vivo), например, при диагностике
скарлатины.
Для диагностики скарлатины в область наиболее обильной сыпи
вводят антисыворотку к эритрогенному токсину; если у больного
скарлатина, то сыпь в месте инъекции пропадает.
5) РН для определения напряженности антитоксического иммуни-
тета к дифтерийному токсину (проба Шика), скарлатинозному ток-
сину (проба Дика) в здоровом организме.
В область предплечья внутрикожно вводят определенное коли-
чество соответствующего токсина (1/40 DLM). При наличии в ога-
низме антитоксинов произойдет нейтрализация токсина и реакция
будет отрицательной. При отсутствии антитоксинов (антитоксичес-
ких АТ) в организме возникает воспалительная реакция (покрасне-
ние) на месте введения токсина. /2551к/
Подкожное введение эритрогенного токсина иммунным лицам при-
водит к нейтрализации токсина (покраснения не будет).
3РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)
_ 5Реакции иммунного лизиса . используются в нескольких вариантах
51) Для определения АТ к эритроцитам барана (ЭБ)
52) Для определения HLA на В-лимфоцитах (лимфоциты + МАТ к
5определенному АГ системы HLA + комплемент --- лизис клеток +
5гемсистема - ЕА (эритроциты /Е/ барана, нагруженные антителами
5/А/ к ним /ЕА/). 6-12 ячеек из 100 будут с целыми эритроцитами,
5остальные - с лизированными (ИК нет, нет активации комплемента,
5нет потребления комплемента, свободный комплемента лизирует
5ЭБ). РСК.
53) Для определения титра АТ к любому АГ (РСК).
4В реакциях иммунного лизиса специфические АТ взаимодействуют
4с различными клетками, в том числе с бактериями и простейшими,
4что приводит к активации системы комплемента по классическому
4пути и последующему лизису клеток. Среди них известны реакции
4гемолиза и вибриолиза. /2400к/98/ 0
5Реакция гемолиза считается активной при использовании АТ к
5эритроцитам барана. При пассивной реакции иммунного лизиса про-
5изводят адсорбцию антигена на эритроцитах барана с последующим
5добавлением искомых антител к АГ-ну и комплемента. 0
2Определение титра антител по РСК
2(реакции связывания комплемента)
1/10 1/100 5 01/1000 5 и т.д. (раститровка)
= 10 5-1 0 = 10 5-2 0 10 5-3 0 5 010 5-4 0 10 5-5 0 10 5-6 0 10 5-7 0 5 0 10 5-7
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤ ├───┤
│ о │ │ о │ │ о │ │ о │ │ - │ │ - │ │ - │ │ - │ │ │
└───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘ └───┘
\________________________/ \_________________________/ Контроли
Эритроциты барана целы Эритроциты барана лизированы
(муть или осевшие на дне)
1Постановка методики:
│- Раститровка сыворотки для определения титра АТ
│+ АГ (музейная культура микробов, лекарственный препарат,
│ анатоксин и пр. --- ИК в первых пробирках по убывающей
│+ комплемент (сыворотка морской свинки) --- связывание ИК с
│ C1q. Инкубация 15 минут.
│+ ЕА (гемсистема; другой вид ИК). Инкубация 15 минут.
│ --- Лизиса в первых пробирках нет, т.к. C1q весь связан с
│ первым типом ИК.
┌────┐ ┌────┐
│ АГ │ │ ЭБ │
└──┬─┘ ┌────┐ └──┬─┘
├────┤ С │ │ --- гемолиза эритроцитов нет
┌──┴─┐ └────┘ ┌──┴─┐ (положительная РСК)
│ АТ │ │ АТ │
└────┘ └────┘
ИК ИК [С- комплемент]
┌────┐ ┌────┐
│ АГ │ │ ЭБ │
└────┘ ┌────┐ └──┬─┘
│ С ├─────┤ --- гемолиз эритроцитов
┌────┐ └────┘ ┌──┴─┐ (отрицательная РСК)
│ АТ │ │ АТ │
└────┘ └────┘
ИК нет или мало ИК
(антител к искомому
АГ нет или мало)
1Примечание 0:
- Сыворотка больного предварительно инактивируется от собс-
твенного комплемента (56 5о 0 20 минут), поскольку активность комп-
лемента у разных больных разная (сбои в результатах).
- Предварительно отрабатывается рабочая доза АГ (не влияющая
сама по себе на реакции активации комплементарного каскада).
- Подбирается рабочая доза комплемента (избыток недопустим,
так как C1q будет оставаться и на ИК второго порядка).
51. Приготовление 5% суспензии эритроцитов барана (Е):
50,5 мл осадка отмытых эритроцитов + 9,5 мл физраствора.
52. Определение титра гемолитической сыворотки (антител /А/
5к эритроцитам барана):
5Титром гемолитической сыворотки считается максимальное раз-
5ведение в объеме 0,5 мл, при котором наблюдается полный гемолиз
50,5мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5мл компле-
5мента (1:10). Пробы выдерживаются при температуре 370С в тече-
5ние 1 часа.
53. Приготовление рабочего раствора гемолитической сыворотки
5(1:3):
5Например, исходный титр 1:2700; 2700 : 3 = 900, т.е. сыво-
5ротку необходимо развести в 900 раз (взять 1/900 часть от ко-
5нечного объема). Если надо 10 мл гемсистемы, то нужно взять
510:900=1/90мл=0,011мл исходной гемолитической сыворотки.
54. Приготовление гемолитической системы (индикаторной систе-
5мы для комплемента):
5Смешиваются равные объемы 5% суспензии эритроцитов барана и
5гемолитической сыворотки (1:6); при этом сыворотка при непре-
5рывном встряхивании выливается в суспензию эритроцитов, а не
5наоборот. Смесь встряхивается 5 минут и инкубируется 30 минут в
5термостате. Отмывается.
55. Определение рабочей дозы комплемента:
5В качестве источника комплемента можно использовать сыворот-
5ку здоровых доноров (при этом комплемент сыворотки инактивиру-
5ется прогреванием в течение 30 минут при 560С) или лиофилизиро-
5ванную сыворотку морской свинки.
5Титр комплемента - то наименьшее количество комплемента, ко-
5торое будучи смешанным с 0,5мл гемолитической сыворотки (в
5трехкратном титре), гемолизирует 0,5мл 3% взвеси эритроцитов в
5течение 30 минут.
5Для титрования пользуются основным разведением комплемента
51:10 и разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5мл. Затем в каж-
5дую пробирку добавляют физраствор до 1,5мл и 1 мл гемолитичес-
5кой системы. Инкубируют 30 минут при 370С и определяют титр
Реферат опубликован: 15/06/2005 (23785 прочтено)