Страница: 7/8
5комплемента. Параллельно ставится два контроля - контроль гемо-
5литической сыворотки (с физраствором) и контроль комплемента.
5Определив титр комплемента, высчитываем рабочую дозу, кото-
5рая представляет собой титр комплемента, увеличенный на 20-30%,
5так как комплемент в опыте подавляется антигеном.
56. Определение рабочей дозы антигена:
5Раститровывают антиген в конечном объеме 1мл, затем добавляют
5комплемент, штатив встряхивают и оставляют на 1 час при 370С. К
5смеси приливают по 1мл гемолитической системы и инкубируют 1
5час.
5Титром считается наименьшая доза, при которой прекращается
5задержка гемолиза, т.е. отсутствует его комплементарное дейс-
5твие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составля-
5ющую примерно 1/2 - 2/3 ее титра во избежание комплементарного
5действия при постановке реакции.
57. Постановка реакции РСК.
5- Раститровывают сыворотку больного, предварительно прогре-
5тую при 520С в течение 20 минут для инактивации собственной
5системы комплемента.
5- Добавляют рабочую дозу антигена,
5- комплемента и инкубируют 10-30 минут при 370С.
5- Затем вносится гемолитическая система и штатив инкубирует-
5ся еще 30 минут при 370С.
5Задержка гемолиза свидетельствует о наличии антител к ис-
5пользуемому антигену в сыворотке больного.
5Учет РСК с парными сыворотками. (титром специфических в дан-
5ному антигену антител считается титр последнего разведения сы-
5воротки, полностью тормозящего гемолитическую реакцию.)
5Титром гемолизина считается наибольшее разведение гемолизи-
5на, с которым получается полный гемолиз 0,5мл взвеси бараньей
5крови в присутствии комплемента.
Реакция Вассермана (РСК) используется для диагностики сифи-
лиса. Антигеном служит экстракт пораженного органа или другой
аналогичный материал.
II. _ 2ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
2ЦЕПНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
5- Не серологическая (без использования АГ и АТ), но также
5гибридизации фрагментов ДНК и РНК. 0 5высокоспецифическая диагнос-
5тическая реакция.
ПЦР - чрезвычайно чувствительный метод, теоретически для по-
лучения результата достаточно иметь в среде одну молекулу ДНК.
/2400к/
5ПЦР была разработана Мюллесом в 1983г. на основе технологии
Методы ДНК-гибридизации и ЦПР используются для геносистема-
тики и идентификации патогенных микроорганизмов. /2287к/96/
1Основа метода 0 - катализируемое ДНК-полимеразой многократное
образование копий (амплификация) определенного участка ДНК.
1Этапы метода:
│- термическое разделение 2-нитевой молекулы ДНК на отдель-
│ ные цепочки (30-40с. при 93-95 5о 0С),
│- охлаждение среды и
│- внесение праймеров, комплементарных нуклеотидным после-
│ довательностям обеих цепочек.
Для запуска реакции используют синтетические _ 1праймеры . 0 - оли-
гонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, взаимодействующие
с окончаниями последовательностей и образующие последователь-
ности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную
полимеразу (tag-полимеразу /от вида бактерии Thermus aquati-
cus/), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК,
после чего образующиеся 2-нитевые молекулы ДНК снова подогрева-
ют. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и
снова повторяют процедуру прогрева и охлаждения. /2400к/
После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их иденти-
фикацию методом электрофореза. /2400к/
5Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы
5можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или
5провести реакцию ДНК-гибридизации. /2400к/
5ПЦР позволяют анализировать геномную ДНК или РНК-транскрип-
5ты, выделенные из единственной клетки. И хотя эти методы не
5требуют большого количества клеток, их ограничения связаны с
5доступностью специфических праймеров и их, как правило, приме-
5няли для выявления уже известных или родственных им генов.
5Такое ограничение было преодолено после разработки методов,
5позволивших амплифицировать весь спектр мРНК. В них использова-
5лась природная особенность всех мРНК нести поли(А+)-последова-
5тельность на 3'-конце. Комплементарная ДНК (кДНК), полученная с
5мРНК в реакции обратной транскрипции, приобретала таким образом
5сайт связывания одного из праймеров для амплификации в ЦПР.
5Другой сайт был образован путем добавления гомополимерного
5хвоста с помощью терминальной трансферазы. Однако все эти мето-
5ды использовали стадию экстракции ДНК, что затрудняло их приме-
5нение в отношении небольшого количества клеток. /2286к/96/ 0
┌──── 76 0 ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ термическая денатурация ДНК (95 5о 0)
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ Отжиг праймеров
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴
│ ┬┬┬┬┬┬ - праймер
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ Синтез комплементарных нитей ДНК при охлаждении
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ 2┴┴┴┴┴┴ 0┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ ┴ ┴ ┬ ┬
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬ 2┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ │
│ │ Завершение первого цикла
│ ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
│ ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
│ +
└───── ┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬┬
и т.д. ┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴┴
5Этот недостаток был преодолен в работе Brady, в которой все
5стадии синтеза кДНК были проведены в одной первичной клеточной
5суспензии без единой экстракции. /2286к/96/
5В последнее время стали пользоваться большой популярностью
5магнитные бусы фирмы "Dynal". Последовательности олиго(дТ)25,
5ковалентно сшитые с бусами, позволяют легко выделять мРНК из
Реферат опубликован: 15/06/2005 (23790 прочтено)