Страница: 5/8
Xho I сайт 1-я цепь EcoR I адаптор
|
|
|
|
5' р-TCGAGTTTTTTTTTTTT,,,,,,,,CTCGTGCCG-р
3'
3' р-CAAAAAAAAAAAA
GAGCACGGCTTAA-р 5'
2-я цепь
|
||||||||
|
||||||||
 |
||||||||
 |
||||||||
Xho I сайт кДНК EcoR I сайт
5' CTCGAGTTTTTTT,,,,,,,,,CTCGTGCCGAATTC 3’
3' GAGCTCAAAAAAA
GAGCACGGCTTAA
G 5’
ДНК вектора ДНК вектора
Рис. 9. Схема синтеза кДНК по матрице поли(A)+РНК и сшивки с плазмидным вектором
pBluescript KS(+) по сайтам EcoR I и Xho I.
Обозначения:,,,,, - метилированная цепь кДНК, -неметилированная цепь кДНК.
1 мкл 10-кратного буфера лигирования,
1 мкл 10 мМ рATФ,
1 мкл фермента ДНК лигазы фага Т4 (4 е.а./мкл).
Смесь инкубировали при 4оС в течение 2-х суток, после чего инактивировали лигазу прогреванием при 70оС в течение 30 мин, охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для фосфорилирования концевых нуклеотидов:
1 мкл 10-кратного буфера лигирования,
2 мкл 10 мМ рATФ,
6 мкл стерильной воды,
1 мкл фермента полинуклеотидной киназы фага Т4 (10 е.а./мкл).
Реакционную смесь инкубировали при 37оС в течение 30 мин. Затем охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для образования липких концов по сайту рестрикции эндонуклеазы Xho I:
28 мкл буфера 4,
3 мкл Xho I (40 е.а./мкл).
Смесь инкубировали при 37оС в течение 1,5 часа. Затем добавляли 5 мкл 10-кратного буфера STE (1 М NaCl, 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ Na2ЭДТА) и пропускали через колонку с гелем сефакрил С-500. Фракции, содержащие молекулы с размером более 500 пн объединяли и экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и равным объемом хлороформа. Затем добавляли двойной объем этанола, осаждали кДНК центрифугированием, промывали 80% этанолом и растворяли в 10 мкл воды. Для лигирования брали 5 мкл раствора кДНК (600 нг) и 2 мкл раствора вектора pBluescript KS(+) (1 мкг), имеющего "липкие" дефосфорилированные концы по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR I и Xho I (рис. 9).
Затем добавляли 1 мкл 10-кратного буфера 3, 1 мкл 10 мМ раствора рATФ и 1 мкл фермента лигазы фага Т4 (4 е.а./мкл). Смесь инкубировали при 4оС в течение 2-х суток, после чего экстрагировали равными обьемами фенол-хлороформа и хлороформа.
Амплификация библиотеки.
Электротрансформацию проводили как описано в п. Трансформация прокариотических клеток, после чего высевали 1/1000 объема (2,5 мкл) среды SOC на селективную среду с ампициллином (50 мкг/мл) для определения количества трансформированных клеток. Остальную часть помещали в 100 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и инкубировали при 37оС при перемешивании до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет величины D550=2-2,5. Затем отбирали 1,6х1011 клеток, осаждали их центрифугированием, суспендировали в 4 мл среды LB и перемешивали с 4 мл глицерина. Полученную библиотеку хранили при -70оС.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Реакционная смесь полимеразной цепной реакции (ПЦР) содержала следующие компоненты:
100 нг ДНК матрицы,
100 нг невырожденного праймера,
500 нг вырожденного праймера,
5 мкл 2 мМ раствора дНTФ,
5 мкл 1-кратного буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,001% желатин),
1 мкл Taq полимеразы,
вода до конечного объема 50 мкл (Dieffenbach and Dveksler, 1995).
Температурный режим ПЦР.
Реакционную смесь инкубировали при 95оС в течение 5 мин, после чего добавляли Taq полимеразу и использовали температурный режим, при котором в течение первых 18 циклов температуру отжига праймеров понижали на 3оС черех каждые три цикла:
1й-18й циклы 95оС - 1 мин (денатурация ДНК),
50-35оС - 1 мин (отжиг праймеров),
72оС - 2 мин (полимеризация).
19-й-30-й циклы: 95оС - 1 мин,
50оС - 1 мин,
72оС - 2 мин.
31-й цикл: 95оС - 1 мин,
50оС - 1 мин,
72оС - 10 мин.
СУБКЛОНИРОВАНИЕ ДНК
Фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР, разделяли в 1% агарозном геле и выделяли как описано в п. Выделение ДНК из геля. Затем осаждали ДНК этанолом, растворяли в 5-10 мкл воды и добавляли компоненты для удаления выступающих нуклеотидов с 3' конца ДНК:
1 мкл 10-кратного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 8,2, 100 мМ KСl, 60 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ MgCl2, 1% тритон Х-100 и 100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин),
1 мкл 10 мМ dНTФ,
1 мкл Pfu ДНК полимеразы (2,5 е.а./мкл),
воду до конечного объема 10 мкл.
Смесь инкубировали 30 мин при 72оС после чего охлаждали до 0оС и добавляли компоненты для сшивки с вектором pBluescript KS(+) по сайту рестрикции Sma I:
1 мкл расщепленного вектора (0,5 мкг),
1 мкл 10-кратного буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 7 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ),
1 мкл 10 мМ дATФ,
1 мкл ДНК лигазы фага Т4 и воду до конечного объема 10 мкл.
Смесь инкубировали одни сутки при комнатной температуре и затем использовали для химической трансформации клеток E.coli. Трансформированные клетки высевали на селективную среду: 1,5% LB-агар с ампициллином (50 мкг/мл), тетрациклином (15 мкг/мл), ИПТГ (2 мМ), X-Gal (500 мкг/мл) и инкубировали 14 часов при 37оС. После этого отбирали колонии белого цвета (Маниатис и др., 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995).
СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ кДНК
Библиотеку кДНК высевали на чашки Петри с 1,5% LB-агаром с ампициллином (50 мкг/мл) из расчета 4000 колоний на чашку и инкубировали при 37оС до тех пор пока колонии не достигнут 0,5-1 мм в диаметре. Колонии переносили на нейлоновую мембрану и инкубировали при комнатной температуре в денатурирующем растворе (0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl) в течение 7 мин и два раза по 2 мин в нейтрализующем растворе (1,5 М NaCl, 0,5 М трис-HCl, рН 7,5). Затем споласкивали мембрану в 2-кратном буфере SSC (0,3 М NaCl, 0,03 М цитрат натрия), высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм. После этого мембрану помещали в 50 мл предгибридизационного раствора (раствор 1), содержащего:
6-кратный SSC (0.9 М NaCl, 0,09 М цитрат натрия),
5-кратный раствор Денхардта (0,1% бычий сывороточный альбумин, 0,1% фикол, 0,1% поливинилпиролидон),
0,5% SDS,
10% декстран сульфат,
500 мкг денатурирированной ДНК цыпленка,
и инкубировали 1 час при 55оС. После этого добавляли меченую 32P-дATФ ДНК зонда и инкубировали 12-18 часов при 55оС при постоянном покачивании.
После гибридизации проводили промывание мембраны два раза по 10 мин в 200 мл 2-кратного SSC + 0,1% SDS при комнатной температуре, 15 мин в 1-кратном SSC + 0,1% SDS% при 55оС и два раза по 10 мин в 0,1-кратном SSC + 0,1% SDS при 55оС. Экспонирование проводилось в течение 12 часов при -70оС с рентгеновской пленкой (Маниатис и др., 1984).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
Нуклеотидную последовательность ДНК определяли по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977). 5 мкг плазмидной ДНК, очищеной гель-фильтрацией на колонке с биогелем П-10, денатурировали в 50 мкл 0.2 М NaOH при 37оС в течение 30 мин, затем добавляли 5 мкл 3 М NaAc, рН 5,1, двойной объем этанола и инкубировали 30 мин при температуре -70оС. После этого осаждали ДНК центрифугированием при 12000 g в течение 12 мин и промывали осадок 100 мкл 80% этанола. Осадок ДНК высушивали при комнатной температуре и растворяли в 7,5 мкл воды, добавляли 2 мкл 5-кратного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl), 0,5 мкл праймера (50 нг) и инкубировали 30 мин при 37оС. После этого пробирку помещали в лед и добавляли 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл 1,5 мкМ дНTФ без дATФ, 0,5 мкл раствора 35S-дATФ и 2 мкл ДНК полимеразы фага Т7 (2,5 е.а./мкл). Затем инкубировали 3 мин при 20оС и сразу отбирали по 3,5 мкл в четыре пробирки, каждая из которых содержала по 2,5 мкл 80 мкМ смеси четырех дНTФ, 50 мМ NaCl и 8 мкМ одного из ддНTФ. Инкубировали 5 мин при 37оС и добавляли по 4 мкл стоп-раствора (95% формамид, 20 мМ Na2ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксилен цианол). Полученные образцы инкубировали 3 мин при 100оС, быстро охлаждали до 0оС и отбирали по 2 мкл для электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле, имеющем состав:
6% акриламид,
8 М мочевина,
1-кратный глицерин-толерантный буфер (1,1% трис, 0,36% таурин, 0,02% Na2ЭДТА).
Электрофорез проводили при напряжении 40 В/см. Затем гель выдерживали 30 мин в 10% уксксной кислоте, высушивали и экспонировали 12 часов при комнатной температуре с рентгеновской пленкой (Маниатис и др., 1984).
САУЗЕРН БЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ
10 мкг геномной ДНК, выделенной из печени стерляди, инкубировали в течение 2 часов с эндонуклеазами рестрикции Pst I и Pvu II (по 50 е.а.) при 37оС в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин, 6 мМ 2-меркаптоэтанол. Затем экстрагировали ДНК последовательно равными объемами фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа, осаждали ДНК двумя объемами этанола, растворяли в воде и наносили на 1% агарозный гель. Электрофорез проводили при напряжении 1 В/см и температуре 12оС в течение 12 часов. Затем гель инкубировали при комнатной температуре 30 мин в 0,25 М HCl, 30 мин в денатурирующем растворе (0,5 М NaOH, 1,5 M NaCl) и 10-15 мин в растворе 1 (0,25 М NaOH, 1,5 M NaCl). После этого ДНК переносили на нейлоновую мембрану методом вакуумного переноса в растворе 1. Мембрану споласкивали в 2-кратном SSC, высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм.
Предгибридизацию проводили при 55оС в течение 1 часа в растворе 1 (см. Скрининг библиотеки кДНК). Гибридизация длилась 12-16 часов при 55оС с концентрацией зонда не более 10 нг/мл.
Отмывку проводили два раза по 10 мин в 2-кратном SSC + 0,1% SDS при комнатной температуре и один раз 15 мин в 1-кратном SSC + 0,1% SDS при 55оС. Экспонирование длилось 12 часов при -70оС (Маниатис и др., 1984).
РЕЗУЛЬТАТЫ
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ СКРИНИНГ
В качестве источника мРНК брали лейкоциты периферической крови стерляди. На основе этой мРНК синезировали кДНК. Полученные молекулы кДНК клонировали в плазмидном векторе pBluescript KS(+), после чего трансформировали этим вектором клетки E.coli штамма XL-1 Blue MRF’. В результате этого была получена библиотека кДНК представительностью 6 миллионов клонов. Библиотеку амплифицировали до объема 5 х 1011 клеток.
Cуммарную плазмидную ДНК библиотеки выделяли и использовали в ПЦР с парой праймеров, один из которых гомологичнен участку вектора вблизи сайта клонирования молекулы кДНК и располагается в кодирующей ориентации. Второй праймер вырожденный, соответствующий наиболее консервативному участку последовательности J-сегментов L-цепей ИГ позвоночных в некодирующей ориентации (рис. 10).
Один из фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР, соответствовал ожидаемому размеру (370 пн). Этот фрагмент выделяли и субклонировали в векторе pBluescript KS(+). Определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента показало, что он гомологичен генам V области L-цепей ИГ (Рис. 11).
Этот фрагмент был использован в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК лейкоцитов стерляди. Скрининг 4000 колоний библиотеки кДНК в мягких условиях гибридизации позволил выявить пять клонов с размером вставки кДНК от 800 до 1050 пн. Для четкого разделения клонов проводили вторичный скрининг библиотеки кДНК, после чего выделенные клоны амплифицировали.
 |
|||||
|
|
|||||
| |||||