Страница: 6/8
прамер Т3
5'-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3';
J-праймер
5'-A(G/C)(T/C)(T/C)TGGT(T/G/C)CCTTTTCC(A/G)AA-3’
Рис. 10. Схема ПЦР. Т3 праймер располагается вблизи сайта клонирования молекулы кДНК и комплиментарен некодирующей цепи, J-праймер гомологичен участку кодирующей цепи J-сегмента генов L-цепей ИГ позвоночных. Ожидаемая длина продуктов около 400 пн.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Определена нуклеотидная последовательность вставки кДНК клона В1. кДНК клона В1 размером 1050 пн представляла собой полноразмерную копию зрелого гена L-цепи ИГ и содержала 5’-нетранслируемую область, последовательность кодирующую лидерный пептид, V область, С область, а также 3’-нетранслируемую область (Рис. 11). На основе первичной структуры клона В1 сконструировали и синтезировали три праймера, соответствующих консервативным районам V и C области и использовали их для определения нуклеотидной последовательности клонов Е4 и С2. Последовательность клона Е4 была определена только в области, примыкающей к Т3 промотору вектора. За исключением 2 нуклеотидов она полностью идентична последовательности В1. Последовательность клона С2 имела химерный характер. В области Т3 промотора она содержала фрагмент соответствующий 3’ части С сегмента клона B1 с заменами нескольких нуклеотидов. В то же время использование для определения последовательности праймеров V и C области показало, что эта вставка содержит дополнительно перестроенный ген легкой цепи, содержащий большую часть V сегмента и второй С сегмент, отличающийся от первого в одной позиции. Поскольку пока не удалось определить последовательность в области стыка этих двух фрагментов вставки, нельзя сказать, находятся ли они в одной или разных ориентациях. По-видимому, сходный химерный характер имеет последовательность клона D2 (данные не показаны).
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Нуклеотидную и предсказанные аминокислотные последовательности клона В1 сравнивали с последовательностями V и C генов L-цепей ИГ других видов позвоночных (Рис 12). На аминокислотном уровне V область имеет наибольшее сходство с V-областями L-цепей класса F и G пещерного сомика и с V-областью L1 класса ИГ форели (63-71%). И те и другие относятся к каппа-типу L-цепей. При поиске гомологов в полном банке последовательностей ИГ млекопитающих первые 100 позиций с наибольшим сходством представляли собой также V каппа области.
С-область клона В1 имеет на аминокислотном уровне приблизительно одинаковое и не очень значительное сходство с широким спектром С-областей L-цепей ИГ хрящевых и костистых рыб (41-44%). На нуклеотидном уровне наиболее близкими гомологами В1С гена являются гены III класса хрящевых рыб (65%).
АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ
Геномную организацию локуса генов L-цепей ИГ стерляди оценивали методом Саузерн блот гибридизации. Геномную ДНК выделяли из печени стерляди. ДНК расщепляли эндонуклеазами рестрикции Pst I и Pvu II. После электрофоретического разделения и переноса фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану проводили гибридизацию в мягких условиях. В качестве зонда на V-гены использовали фрагмент, полученный в результате ПЦР (см. Конструирование библиотеки кДНК и ее скрининг). В качестве С-зонда использовали участок кДНК клона В1, кодирующий CL сегмент, который вырезали по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR V-Xho I.
V-зонд выявлял более 20 гибридизующихся фрагментов ДНК, в то время как С-зонд гибридизовался только с 3-4 фрагментами (рис. 13).
5' нетранслируемая область |> лидерный пептид
1 15 30 45 60 75 90
B1 . .TTCATGGCAACA GAATCCACAACAACA ATGACTTTTATCAGC ATCTTCATCTGGGCA CTTGTCATCTGCACT CAGGAATCCAGTGGA
E4 CCC----A------- --------------- --------------- --------------- --------------- ---------------
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
|> V сегмент FR 1 |> CDR 1
105 120 135 150 165 180
B1 CAGTATACTGTGACT CAGACTCCAGCAGAG AAATCTGTTCTCCCA GGAGACACAGTCGCT CTCAACTGTAAAGTC AACAGCGCAGTCCTT
E4 --------------- --------G----T- --------------- ----------. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
|> FR 2 |> CDR 2 |> FR 3
195 210 225 240 255 270
B1V GGTAATACGTACCTG CACTGGTACCAACAG AAACCTGGAGAAGCT CCCAAACTCCTGATC TATAGGGCAAGTACC CTTGAGTCTGGGATC
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ---- ---C-----------
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . .------------ -----------A--- ---TAT----T--AG ---C-------N---
285 300 315 330 345 360
B1 CCAACTCGTTTCAGT GGCAGTGGATCTGGG ACTGACTTCACTCTG ACCATCAGTGGAGTC CAGGCTGAAGATGAA GGAGATTACTACTGT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------C----C- --------------- --------------- --------------- --------------- --------T------
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR --------------- ------------TT- --------------- --------------- -------------C- ---------------
|> CDR 3 |> J сегмент |> С сегмент
375 390 405 420 435 450
B1 GTCAGTGTACACTAC TCCAGCAGTAGATAT GTGTTGACTTTCGGG CCCGGGACCAAACTA ATTGTGAAATCTGGA AGCCCCACTGCTCCT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 CAG---TC------- C----------C-G- -NCC-C--------A --A--------G--G G-------------- -A-------------
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
PCR CAG---CAC---ACT C---ATG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
465 480 495 510 525 540
B1 TCCTCCGTCTCCCTG CTTCCTCCCTCCAAG CTGGAGCTCGACTCA AAGGGTAAAGCCACC CTGGTCTGCCTGGTG AATAATTTCTACCCT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------------- --------------- ------------A-- -----C--------- TG------------- --------------C
C2(T3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . -C--------- T-------------- --------------C
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
555 570 585 600 615 630
B1 GATGTCGTGGATATC AAGTGGACGGTGGAC GGGGTGGCCCAGTCG TCTGGTGTGCTGACC AGCACAATGAAGCAG AAGGATGGGAAATAC
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------------- --------------T ----C---------- --------------- --------------- -----C---------
C2(T3) --------------- --------------T ----C---------- --------------- --------------- -----C---------
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
645 660 675 690 705 720
B1 AGTGCAAGCAGCAGC CTGACCCTCACCAAG GCCGTGTGGAACAGC AAGGAGACATACACC TGCACTGTGAAGCAC GAGGCTGTGAGCACT
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 --------------- --------------- -A------------- --------------- --------------- ---------------
C2(T3) --------------- --------------- -A------------- --------------- --------------- ---------------
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
|> 3' нетранслируемая область
735 750 765 780 792
B1 CCCAGGAGCGAGTCC ATCAAGAGGAGCGAG TGCACACTATTAGAT GCCtaaAGG . . . . . . . . .
E4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C2 --G----------T- --------------- --------------- ---taaG-CAAGAGA ATCCGTGTGATT
C2(T3) --G----------T- --------------- --------------- . . . . . . . . . . . . . .
PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Рис. 11. Нуклеотидная последовательность полноразмерной кДНК клона В1 и частичная последовательность кДНК клонов Е4 и С2 и продукта ПЦР. Последовательность кДНК клона С2 определялась с использование праймеров V1, V2, C1 (обозначение С2) и Т3 (обозначение С2(Т3)). Прочерк означает идентичность в этой позиции с кДНК клона В1, FR - каркасные участки, CDR - гипервариабельные участки V области.
Реферат опубликован: 18/04/2005 (16263 прочтено)