Страница: 6/7
ми микробами, выраженное в процентах. /272-53/
_ 2Методики . 1:
Фагоцитарную активность можно определять в условиях in vitro
и в условиях in vivo.
I. In vitro.
- Методы оценки экспрессии С3- и Fс-рецепторов по тесту РОК;
- Радиометрические методы изучения стадии захвата.
- Тест восстановления нитросинего тетразолия. По реакции
восстановления нитросинего тетразолия судят об стимуляции гек-
созомонофосфатного шунта. /1583-4/
II. In vivo.
Белым мышам вводят в/бр. 2мл стерильного МПБ, чем вызывают-
локальный лейкоцитоз. Через 4 часа в/бр. вводят 1мл 2млрд-ой
культуры Staphylococcus albus. Через 10-15 минут из перитоне-
альной жидкости готовят мазки (можно из осадка после центрифу-
гирования), окрашивают метиленовым синим.
2Незавершенный фагоцитоз 0 (наблюдается при поглощении туберку-
лезных палочек, возбудителей лепры, лейшманиоза, гонореи, ме-
нингококков, вирусов, риккетсий) :
Рис. "Незавершенный фагоцитоз гонококков (мазок in vivo)"
Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - процентное отно-
шение умерщвленных и всех поглощенных микробов (примерно равно
0,80). Выделяют 5 степеней завершенности фагоцитоза (ЗФ):
- высокая ЗФ (1,0-0,82);
- средняя (0,81-0,45);
- слабая (0,44-0,32);
- очень слабая (0,31-0,29)
- ЗФ отсутствует (0,28-0,25)
2Фагоцитарная активность
(фагоцитоз стафилококка)
Реакцию осуществляли по методу Н.В.Васильева и соавт.
(1972). Для постановки реакции в лунки иммунологического план-
шета вносили по 15 мкл гепарина в концентрации 10 ед/мл, 50 мкл
цельной крови, взятой с пальца натощак, и добавляли 25 мкл 2 х
10 59 0 микробных тел/мл суточной агаровой культуры Staphylococcus
aureus разведенных на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2. В опытные
лунки вводили по 10 мкл расстворов изучаемых полипептидов, в
контрольные - 10 мкл фосфатного буфера. Лейкоцитарно-микробную
взвесь перемешивали и инкубировали при температуре 37С в тече-
ние 30 минут, повторно встряхивая каждые 5 минут. После инкуба-
ции взвесь ресуспендировали, готовили мазки, фиксировали 10 ми-
нут метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.
Готовые препараты микроскопировали с использованием масляной
иммерсии и вели подсчет в 200 нейтрофилах. Поглотительную спо-
собность фагоцитов оценивали по следующим показателям:
1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитировавших кле-
ток из числа сосчитанных нейтрофилов;
2) фагоцитарный индекс - среднее число микробов, поглощен-
ных одним активным нейтрофилом.
Для оценки переваривающей функции нейтрофилов определяли
показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) по формуле:
общее количество переваренных микробов
ПЗФ = ────────────────────────────────────── х 100 %.
общее количество поглощенных микробов
Чувствительным методом оценки функциональной активности фа-
гоцитов является метод определения хемилюминесценции крови.
/7062/
- Приготовить кровяно-микробную взвесь (0,05мл 2% цитрата
натрия, 0,1мл крови и 0,05мл 2 млрд-ой взвеси микробов - микро-
кокков);
- для определения опсонического индекса в опытную пробу до-
полнительно добавляетя антисыворотка к микробам или сыворотка
больного для определения функциональной активности антител к
микробам;
- выдержать в термостате 30 мин. при 37 50 0С.
- приготовить мазок из кровяно-микробной взвеси;
- высушить мазок, окрасить по методу Филлипсон: краситель
Романовского развести этиловым спиртом 1:3. На высушенный пре-
парат наносят 5 капель красителя и выдерживают 5 минут (однов-
ременная фиксация и окраска). Не сливая краску, добавляют во-
допроводную воду, 5 капель на 5 минут. Промывают водой, высуши-
вают, микроскопируют с иммерсией.
- В мазке определяют
а) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих лейко-
цитов (среди полиморфоядерных лейкоцитов). Подсчитывают
100 гранулоцитов и, например, если 35 из них водержат
микробы, то фагоцитарный индекс равен 35%.
б) фагоцитарное число или индекс (количество микроорганиз-
мов, поглощенных одним нейтрофилом); считают суммарное
количество микроорганизмов, например, 567 во всех фаго-
цитирующих гранулоцитах /80/ и делят на число фагоци-
тов. Частное от деления (567:80=7) отражает сруднюю
поглотительную способность одного фагоцита.
в) определяют опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ). Для этого
либо рассчитывают частное от деления ФЧ (фагоцитарного
числа) больного на ФЧ здорового донора (при этом ОФИ
должен быть больше единицы; либо ОФИ определяют эмпири-
ческим методом, с помощью которого анализируют состоя-
ние 25 нейтрофилов по следующей схеме:
──────────────────────────────────────────────────────────────
Количество микро-│Оценка фагоцитоза│Количество нейт- │ ОФИ
бов, фагоцитиро- │ │рофилов с данной │
ванный одним │ │степенью фагоци- │
гранулоцитом │ │тарной активности│
──────────────────────────────────────────────────────────────
0 0 2 0х2=0
от 1 до 20 + (один) 5 1х5=5
от 20 до 40 ++ (два) 10 2х10=20
от 40 и более +++ (три) 8 3х8+24
Итого: ОФИ=49
Максимальное значение ОФИ - 75, т.е. во всех 25 нейтрофилах
фагоцитировано от 40 и более микробов. У здоровых людей ОФИ ра-
вен 10.
ОФИ от 10 до 24 - слабо положительный (+);
от 25 до 49 - ясно выраженная реакция (++);
от 50 до 75 - резко положительная реакция (+++).
Полученые результаты внести в протокол.
Фагоцитарный показатель у здорового человека - 70-84%.
Фагоцитарное число у здорового человека - 4-?.
Фагоцитарное число после обработки микробов антителами (им-
мунной сывороткой) или комплементом -
Опсонический индекс - больше 1.
Фагоцитоз культуры стафилококка или микрококков в отсутствие
антител идет плохо, при наличии антител в сыворотке или плазме
фагоцитоз ускоряется, при добавлении комплемента или активации
комплемента в крови исследуемого фагоцитоз резко ускоряется,
т.к. происходит как через Fc-, так и через С3в-рецепторы.
2Оценка степени перекисного и радикального окисления
2по НСТ-тесту 0 (NBT-тест)
1Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)
Тест бессубстратного восстановления нитросинего тетразолия
основан на способности фагоцитов утилизировать кислород с обра-
зованием высокореактогенных свободных радикалов. НСТ является
индикатором респираторного взрыва. Сущность метода заключается
в образовании нерастворимых окрашенных зерен формазана при
восстановлении НСТ супероксидным радикалом.
Метод высокоинформативен
- для оценки функциональной активности фагоцитов,
- прогнозирования тяжести заоблевания,
- контроля за эффективностью антибактериального лечения,
- дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных за-
болеваний и пр. /2291к/
- Получены доказательства высокого уровня корреляции между
образованием активных форм кислорода и киллингом.
Метод Н.Е.Виксмана, А.Н.Маянского (1979). Изучаемые образцы
веществ в количестве 20 мкл вносили в лунки иммунологического
планшета, в контрольные лунки - 20 мкл среды 199. В каждую из
лунок вносили по 20 мкл цельной крови, взятой из пальца здоро-
вых людей пипеткой, предварительно промытой раствором гепарина
250 ед/мл и добавляли 20 мкл 0,15% суспензии нитросинего тетра-
золия (Reanal, Венгрия) на 0,1 М фосфатном буферном растворе,
рН 7,2. Содержимое лунок осторожно перемешивали и инкубировали
при температуре 37 5о 0С в течение 30 минут, встряхивая планшеты
каждые 10 минут. После инкубации содержимое перемешивали, гото-
вили мазки и высушивали на воздухе. Готовые мазки фиксировали
метанолом 10 минут, высушивали и докрашивали 0,5% раствором
сафранина.
В качестве активаторов фагоцитов рекомендуется использовать
опсонизированный зимозан или акктиватор протеинкиназы С - фор-
болмиристат ацетат. /2291к/
Об интенсивности радикалообразования судят по количеству ди-
формазана, который откладывается в виде грубодисперсных темно-
синих гранул внутри или на поверхности активированного нейтро-
Реферат опубликован: 16/06/2005 (13623 прочтено)