Эндоцитоз

Страница: 6/7

ми микробами, выраженное в процентах. /272-53/

_ 2Методики . 1:

Фагоцитарную активность можно определять в условиях in vitro

и в условиях in vivo.

I. In vitro.

- Методы оценки экспрессии С3- и Fс-рецепторов по тесту РОК;

- Радиометрические методы изучения стадии захвата.

- Тест восстановления нитросинего тетразолия. По реакции

восстановления нитросинего тетразолия судят об стимуляции гек-

созомонофосфатного шунта. /1583-4/

II. In vivo.

Белым мышам вводят в/бр. 2мл стерильного МПБ, чем вызывают-

локальный лейкоцитоз. Через 4 часа в/бр. вводят 1мл 2млрд-ой

культуры Staphylococcus albus. Через 10-15 минут из перитоне-

альной жидкости готовят мазки (можно из осадка после центрифу-

гирования), окрашивают метиленовым синим.

2Незавершенный фагоцитоз 0 (наблюдается при поглощении туберку-

лезных палочек, возбудителей лепры, лейшманиоза, гонореи, ме-

нингококков, вирусов, риккетсий) :

Рис. "Незавершенный фагоцитоз гонококков (мазок in vivo)"

Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - процентное отно-

шение умерщвленных и всех поглощенных микробов (примерно равно

0,80). Выделяют 5 степеней завершенности фагоцитоза (ЗФ):

- высокая ЗФ (1,0-0,82);

- средняя (0,81-0,45);

- слабая (0,44-0,32);

- очень слабая (0,31-0,29)

- ЗФ отсутствует (0,28-0,25)

2Фагоцитарная активность

(фагоцитоз стафилококка)

Реакцию осуществляли по методу Н.В.Васильева и соавт.

(1972). Для постановки реакции в лунки иммунологического план-

шета вносили по 15 мкл гепарина в концентрации 10 ед/мл, 50 мкл

цельной крови, взятой с пальца натощак, и добавляли 25 мкл 2 х

10 59 0 микробных тел/мл суточной агаровой культуры Staphylococcus

aureus разведенных на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2. В опытные

лунки вводили по 10 мкл расстворов изучаемых полипептидов, в

контрольные - 10 мкл фосфатного буфера. Лейкоцитарно-микробную

взвесь перемешивали и инкубировали при температуре 37С в тече-

ние 30 минут, повторно встряхивая каждые 5 минут. После инкуба-

ции взвесь ресуспендировали, готовили мазки, фиксировали 10 ми-

нут метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Готовые препараты микроскопировали с использованием масляной

иммерсии и вели подсчет в 200 нейтрофилах. Поглотительную спо-

собность фагоцитов оценивали по следующим показателям:

1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитировавших кле-

ток из числа сосчитанных нейтрофилов;

2) фагоцитарный индекс - среднее число микробов, поглощен-

ных одним активным нейтрофилом.

Для оценки переваривающей функции нейтрофилов определяли

показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) по формуле:

общее количество переваренных микробов

ПЗФ = ────────────────────────────────────── х 100 %.

общее количество поглощенных микробов

Чувствительным методом оценки функциональной активности фа-

гоцитов является метод определения хемилюминесценции крови.

/7062/

- Приготовить кровяно-микробную взвесь (0,05мл 2% цитрата

натрия, 0,1мл крови и 0,05мл 2 млрд-ой взвеси микробов - микро-

кокков);

- для определения опсонического индекса в опытную пробу до-

полнительно добавляетя антисыворотка к микробам или сыворотка

больного для определения функциональной активности антител к

микробам;

- выдержать в термостате 30 мин. при 37 50 0С.

- приготовить мазок из кровяно-микробной взвеси;

- высушить мазок, окрасить по методу Филлипсон: краситель

Романовского развести этиловым спиртом 1:3. На высушенный пре-

парат наносят 5 капель красителя и выдерживают 5 минут (однов-

ременная фиксация и окраска). Не сливая краску, добавляют во-

допроводную воду, 5 капель на 5 минут. Промывают водой, высуши-

вают, микроскопируют с иммерсией.

- В мазке определяют

а) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих лейко-

цитов (среди полиморфоядерных лейкоцитов). Подсчитывают

100 гранулоцитов и, например, если 35 из них водержат

микробы, то фагоцитарный индекс равен 35%.

б) фагоцитарное число или индекс (количество микроорганиз-

мов, поглощенных одним нейтрофилом); считают суммарное

количество микроорганизмов, например, 567 во всех фаго-

цитирующих гранулоцитах /80/ и делят на число фагоци-

тов. Частное от деления (567:80=7) отражает сруднюю

поглотительную способность одного фагоцита.

в) определяют опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ). Для этого

либо рассчитывают частное от деления ФЧ (фагоцитарного

числа) больного на ФЧ здорового донора (при этом ОФИ

должен быть больше единицы; либо ОФИ определяют эмпири-

ческим методом, с помощью которого анализируют состоя-

ние 25 нейтрофилов по следующей схеме:

──────────────────────────────────────────────────────────────

Количество микро-│Оценка фагоцитоза│Количество нейт- │ ОФИ

бов, фагоцитиро- │ │рофилов с данной │

ванный одним │ │степенью фагоци- │

гранулоцитом │ │тарной активности│

──────────────────────────────────────────────────────────────

0 0 2 0х2=0

от 1 до 20 + (один) 5 1х5=5

от 20 до 40 ++ (два) 10 2х10=20

от 40 и более +++ (три) 8 3х8+24

Итого: ОФИ=49

Максимальное значение ОФИ - 75, т.е. во всех 25 нейтрофилах

фагоцитировано от 40 и более микробов. У здоровых людей ОФИ ра-

вен 10.

ОФИ от 10 до 24 - слабо положительный (+);

от 25 до 49 - ясно выраженная реакция (++);

от 50 до 75 - резко положительная реакция (+++).

Полученые результаты внести в протокол.

Фагоцитарный показатель у здорового человека - 70-84%.

Фагоцитарное число у здорового человека - 4-?.

Фагоцитарное число после обработки микробов антителами (им-

мунной сывороткой) или комплементом -

Опсонический индекс - больше 1.

Фагоцитоз культуры стафилококка или микрококков в отсутствие

антител идет плохо, при наличии антител в сыворотке или плазме

фагоцитоз ускоряется, при добавлении комплемента или активации

комплемента в крови исследуемого фагоцитоз резко ускоряется,

т.к. происходит как через Fc-, так и через С3в-рецепторы.

2Оценка степени перекисного и радикального окисления

2по НСТ-тесту 0 (NBT-тест)

1Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

Тест бессубстратного восстановления нитросинего тетразолия

основан на способности фагоцитов утилизировать кислород с обра-

зованием высокореактогенных свободных радикалов. НСТ является

индикатором респираторного взрыва. Сущность метода заключается

в образовании нерастворимых окрашенных зерен формазана при

восстановлении НСТ супероксидным радикалом.

Метод высокоинформативен

- для оценки функциональной активности фагоцитов,

- прогнозирования тяжести заоблевания,

- контроля за эффективностью антибактериального лечения,

- дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных за-

болеваний и пр. /2291к/

- Получены доказательства высокого уровня корреляции между

образованием активных форм кислорода и киллингом.

Метод Н.Е.Виксмана, А.Н.Маянского (1979). Изучаемые образцы

веществ в количестве 20 мкл вносили в лунки иммунологического

планшета, в контрольные лунки - 20 мкл среды 199. В каждую из

лунок вносили по 20 мкл цельной крови, взятой из пальца здоро-

вых людей пипеткой, предварительно промытой раствором гепарина

250 ед/мл и добавляли 20 мкл 0,15% суспензии нитросинего тетра-

золия (Reanal, Венгрия) на 0,1 М фосфатном буферном растворе,

рН 7,2. Содержимое лунок осторожно перемешивали и инкубировали

при температуре 37 5о 0С в течение 30 минут, встряхивая планшеты

каждые 10 минут. После инкубации содержимое перемешивали, гото-

вили мазки и высушивали на воздухе. Готовые мазки фиксировали

метанолом 10 минут, высушивали и докрашивали 0,5% раствором

сафранина.

В качестве активаторов фагоцитов рекомендуется использовать

опсонизированный зимозан или акктиватор протеинкиназы С - фор-

болмиристат ацетат. /2291к/

Об интенсивности радикалообразования судят по количеству ди-

формазана, который откладывается в виде грубодисперсных темно-

синих гранул внутри или на поверхности активированного нейтро-

Реферат опубликован: 16/06/2005 (13684 прочтено)