Страница: 50/52
ясняется это тем, что G-C связь более прочная по сравнению
со связью между нуклеотидами A и T. Подобные различия в ди-
намике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвиж-
ности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при
их электрофорезе в денатурирующих условиях ( Рис.4.5). Гра-
диент денатурации достигается разницей температур, различной
концентрации мочевины или формальдегида в гелях. При этих
условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК,
отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатуриру-
ют по -разному . Разработан компьютерный алгоритм, позволяю-
щий предсказывать характер плавления в зависимости от нукле-
отидной последовательности (Lerman, Silverstein, 1987). При
электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в
геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денату-
рирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго
специфичной для данной последовательности области, эквива-
лентной температуре плавления - tm, то есть такой температу-
ре, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью
может соединиться или разойтись. После начала плавления
продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедля-
ется вследствие сложной пространственной конфигурации моле-
кул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не
наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит
разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному
составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около
50% однонуклеотидных замен в фрагментах ДНК длиной от 50 до
нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при
прохождении ДНК через гель может начаться частичная денату-
рация концов молекул еще до достижения оптимальной области
плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов ам-
плифицированных участков ДНК, оказывают меньшее влияние на
процесс плавления и поэтому могут не выявляться. Эффектив-
ность обнаружения мутаций с помощью градиентного денатуриру-
ющего электрофореза может быть существенно повышена за счет
присоединения к концам амплифицированной геномной ДНК синте-
тических фрагментов GC-нуклеотидов, длиной в несколько
десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие концы
выполняют роль своеобразных зажимов и резко увеличивают
шансы обнаружения для всех точечных мутаций, независимо от
их локализации внутри исследуемого фрагмента ДНК. Эта моди-
фикация делает метод очень чувствительным (см.Таб.4.2). В
отличии от SSCP он пригоден для более крупных амплифициро-
ванных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 600
п.о. эффективность выявления мутаций этим методом достигает
95%. Чаще всего DGGE -метод применяется для скрининга мута-
ций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы
используют геномную ДНК. Этот метод может быть с успехом
применен также для анализа индуцированных мутаций, так как
позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в од-
ной из 100 обработанных мутагеном клеток. К недостаткам ме-
тода следует отнести техническую сложность получения равно-
мерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном
геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных
GC-концов.
HA (Неteroduplex analysis) - гетеродуплексный анализ поз-
воляет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или
в гетерозиготном состоянии. Следует заметить, что у подавля-
ющего большинства пациентов с генными болезнями, наследуемы-
ми по аутосомно-рецессивному типу, мутации в гомологичных
хромосомах находятся в компаунде, то есть в каждом из гомо-
логичных генов имеются функционально значимые нарушения, но
их молекулярная природа и внутригенная локализация различны.
Исключение составляют лишь мажорные мутации, частота которых
в популяции достигает десятков процентов. Примерами таких
мутаций являются ^F508 в гене муковисцидоза или R408W мута-
ция в гене фенилкетонурии. Принцип HA-метода заключается в
том, что при амплификации относительно небольших фрагментов
генов гетерозигот или гомозиготных компаундов мутация может
быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матрич-
ной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя ти-
пами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормаль-
ной и мутантной цепочками ДНК. Такие гетеродуплексные моле-
кулы ДНК имеют иную электрофоретичеcкую подвижность по срав-
нению с гомодуплексами (не отличающимися между собой по под-
вижности) за счет конформационных особенностей в местах
несовпадения нуклеотидов (mismatch) (Рис.4.6). Эти различия
могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакри-
ламидном геле. Значительно более эффективное разделение гомо-
и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании
новых вариантов гелей - Hydrolink либо MDE. Вероятность
идентификации точечных мутаций этим способом на фрагментах
ДНК менее 300 п.о. достигает 80-90%. Детекция мутаций осу-
ществляется как изотопным, так и неизотопными методами
(Grompe, 1993).
CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод химического
расщепления некомплементарных сайтов, основан на способности
некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК
в месте локализации неспаренного основания (Рис.4.7). Так,
цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, а тимин - к
действию тетроксида осмия. Некоторые модификации метода
используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимиду.
Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву
молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций
осуществляют с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих,
как правило, нормальным вариантам последовательности ДНК.
Такими зондами могут быть синтезированные олигонуклеотиды,
клонированные последовательности ДНК или амплифицированные
фрагменты (Cotton, 1990; Cotton, Malcolm, 1991).
При проведении исследования эталонную меченую ДНК сме-
шивают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми
образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные
соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные
фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых
молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образо-
вания дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах
ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации
между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК,
образуются места негомологичного спаривания. После обработки
соответствующими химическими агентами идентификация и лока-
лизация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК прово-
дится путем электрофореза и авторадиографии. Появление уко-
роченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее нео-
бычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии
мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагмен-
тов однозначно определяет локализацию этого сайта в исходной
тестируемой молекуле ДНК. Современные модификации метода
CMC позволяют идентифицировать до 95-100% мутаций
(Grompe,1993). Большими преимуществами этого метода являются:
(1) возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2
кб, (2) способность одновременно выявить и локализовать
несколько мутаций в одном фрагменте ДНК и (3) возможность
одновременно использовать несколько ДНК-зондов для поиска
мутаций - мультиплексный вариант методики. К числу недостат-
ков можно отнести высокую токсичность используемых хими-
ческих реактивов. Последняя может быть частично ослаблена
использованием карбодиимида для идентификации GT гетеродуп-
лексов.
Весьма близким по принципу к CMC- методу является метод
расщепления гетеродуплексов РНКазой А. С этой целью созда-
ются условия для образования гетеродуплексов между тестируе-
мой ДНК и комплементарной ей радиоактивно меченой РНК про-
бой. При обработке РНКазой А происходит разрезание молекул
РНК в местах нарушения спаривания оснований. Места точечных
мутаций определяются как и в случае СМС, по размерам образо-
вавшихся фрагментов после электрофореза и авторадиграфии.
Необходимость использования радиоактивно меченой РНК- пробы
и возможность детекции только около 50% точечных мутаций ли-
митируют широкое применение метода (Grompe, 1993).
Первичная идентификация мутаций может быть осуществлена
путем анализа нарушений не в нуклеотидной последовательности
гена, а в аминокислотной последовательности соответствующего
полипептидного продукта. Для этого выделяют тотальную мРНК
из лейкоцитов крови, проводят обратную транскрипцию, ампли-
фицировуют специфические экзоны кДНК (метод RT-PCR), встраи-
вают амплифицированную область ДНК в экспрессионную систему
и анализируют образовавшийся продукт. Этот метод особенно
эффективен при детекции мутаций в протяженных генах, содер-
жащих большое число экзонов, таких как ген миопатии Дюшенна
или ген нейрофиброматоза 1.
Раздел 4.6. Молекулярное сканирование известных мутаций.
Реферат опубликован: 26/04/2005 (122632 прочтено)