Страница: 13/26
реакцию гемолиза останавливали погружением пробирок в ледяную
баню и разведением системы охлажденным забуференным физиологи-
ческим раствором (2,5 мл буфера). Эритроциты осаждали при 3000
об/мин в течение 5 минут. Степень лизиса эритроцитов определяли
спектрофотометрически по оптической плотности супернатанта при
длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыворотку.
Для определения _альтернативного пути активации . системы комп-
лемента /АПК/ (Козлов Л.В., Соляков Л.С., 1982; Tanaka S. et
al., 1986) к 280 мкл веронал-мединалового буфера (рН 7,4), со-
держащего 5 мМ MgCl2 и 10 мМ этиленгликоль-тетрауксусной кисло-
ты добавляли рабочую дозу сыворотки здоровых доноров (20 мкл) и
20 мкл исследуемого полипептида. Смесь инкубировали при комнат-
ной температуре 20 минут, а затем добавляли 200 мкл суспензии
эритроцитов кролика в буфере (1,5х10 58 _ 0 .клеток/мл). Смесь встря-
хивали и помещали в водяную баню при температуре 37С на 20 ми-
нут. Реакцию гемолиза останавливали добавлением 2,5 мл охлаж-
денного до 4С забуференного физиологического раствора, а затем
содержимое пробирок центрифугировали при 3000 об/мин в течение
5 минут. Степень лизиса эритроцитов определяли на спектрофото-
метре при длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыво-
ротку.
Гемолитический метод титрования комплемента
2по 50% или 0 2100%-му гемолизу
Титром комплемента является наменьшее количество исследуемой
активности сыворотки, способствующее полному гемолизу добавлен-
ного количества (0,5-1 мл) сенсибилизированных эритроцитов.
Для титрования комплемента по 100%-му гемолизу активную исс-
ледуемую сыворотку, разведенную в 10 раз, разливают в 11 проби-
рок в количестве 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 ... 1; 1,1 мл. Сыворотку
доводили физиологическим раствором до 1,5 мл, после чего в каж-
дую пробирку добавляют 1 мл гемолитической системы (1,5% взвесь
эритроцитов барана, обработанных антителами в конечном титре
1:3). Учет результатов производили после 45-минутного инкубиро-
вания взвеси в термостате при 37 50 0С.
Для расчета берут пробирку, в которой получен полный гемо-
лиз. Например, полный гемолиз произошел в пробирке N 4 с дозой
активной сыворотки 0,4мл; следовательно, титр комплемента равен
0,04.
СН 450 0 - минимальное количество сыворотки, которое вызывает
лизис 50% сенсибилизированных бараньих эритроцитов, находящихся
в 0,5мл стандартной суспензии при 37 50 0С в течение 30 минут.
1Количественное определение уровня комплемента
1в весовых 3 1единицах
Среди больных с бактериальными инфекциями (пневмония, сеп-
сис) опсонический резерв альтернативного пути активации компле-
мента нередко в 5-10 раз ниже нормы. /7062/ Классический путь
более устойчив к нарушениям внутренней среды и менее пригоден
для их регистрации. /7062/ При падении активности АПК до 30% от
среднего уровня взрослых септические проявления пиогенного про-
цесса отмечали у 80% больных. /7062/
2Приготовление реагентов 0 для определения
активности отдельных компонентов комплемента
_Сыворотка человека. . Донорскую кровь отбирали в сухую сте-
рильную посуду и оставляли на 2 суток при 4 5о 0С. После этого сы-
воротку крови сливали декантацией и центрифугировали в течение
20 мин при 3000g. Супернатант разливали по пробиркам и хранили
при -70 5о 0С.
_Приготовление реагента R2 для определения гемолитической ак-
_тивности компонента С2 .. Сыворотку разливали в тонкостенные про-
бирки по 3 мл и инкубировали в водяном термостате при 50 5о 0С
(внутри пробирок). Отбирали пробы через каждые 10 мин, опреде-
ляя активность компонентов С1, С1q, С4 и контроль на гемолиз по
методике определения С2, используя в качестве R2 отобранную
пробу. В качестве R2 выбирали сыворотку, инкубированную в тече-
ние такого времени, при котором сохраняется активность компо-
нентов С1 и С4 при достаточно низком контроле. R2 хранили при
-70 5о 0С в течение года.
_Приготовление реагента R4 для определения гемолитической ак-
_тивности компонента С4 .. К 1 мл комплемента морской свинки до-
бавляли 0,25 мл 0,075 М раствора гидразингидрата, смесь инкуби-
ровали 1,5 ч при 20 5о 0 и нейтрализовали добавлением 0,25 мл 0,15
М HCl, после чего диализовали против РВS в течение 18 ч при
4 5о 0С. Реагент хранили при -70 5о 0С и использовали в качестве R4
после предварительного разбавления VBS 52+ 0 в соотношении 1:3.
_Приготовление реагента R3 для определения гемолитической ак-
_тивности компонента С3 .. К 10 мл охлажденной до 4 5о 0С свежей сыво-
ротки при непрерывном перемешивании медленно приливали 10 мл
охлажденного насыщенного при 4 5о 0С раствора КВr. Смесь инкубиро-
вали 18 ч при 4 5о 0С, затем диализовали в течение 18 ч против PBS.
Реагент хранили при -70 5о 0С. В качестве R3 использовали реагент,
разбавленный VBS 52+ 0 в соотношении 2:3.
_Приготовление реагента R3 . 5oxy _ 0 для определения гемолитической
_активности компонента ..
Реагент R3 5oxy 0 готовили окислением компонента С2 в реагенте
R3. Реагент R3 готовили как описано выше. Окисляющий раствор
готовили растворением 8,3 г KI и 0,25 г I 42 0 в 4 мл фосфатного
буфера, рН 6, ионная сила 0,1 (105 мл 1 М NaH 42 0PO 44 0 + 35 мл 0,5 M
Na 42 0HPO 44 0 + H 42 0O до 1,5 л), затем доводили объём до 10 мл тем же
буфером. Хранили в темной склянке при 4 5о 0 в течение недели.
Окисляющий раствор (10 мкл) добавляли к 2 мл реагента R3 инку-
бировали 5 мин при 4 5о 0 и нейтрализовали избыток иода добавлением
1 мг глюкозы на 1 мл пробы. Реагент R3 5oxy 0 хранили при -70 5о 0 и
использовали в качестве реагента R3 5oxy 0 после предварительного
разбавления VBS 52+ 0 в соотношении 1:3.
_Приготовление реагента R1q с помощью IgG-стекла ..
К 10 мл сыворотки крови человека добавляли 37,2 мг ЭДТА 5. 0Na 42 0,
осторожно перемешивали на магнитной мешалке до растворения соли
(конечная концентрация 10 мМ) и доводили 0,15 М NаОН до рН 7,2.
Подготовленную таким образом сыворотку наносили на колонку с
IgG-стеклом (9,5х2 см), уравновешенную TBSE, со скоростью 15
мл/ч. Колонку промывали 50 мл TBSE со скоростью 35 мл/ч. Фрак-
ции несвязавшегося на колонке белка (50 мл) не проявляли актив-
ности С1q. Фракции несвязавшегося белка с максимальным поглоще-
нием при 280 нм объединяли (18 мл), добавляли раствор, содержа-
щий 0,3 М CaCl 42 0, 1 M MgCl 42 0, pH 7,4, из расчета 15 мкл раствора
на 1 мл фракции, доводили до рН 7,4, диализовали в течение ночи
против VBS 52+ 0, разливали небольшими аликвотами по пробиркам, за-
мораживали и хранили при -70 5о 0С. Использовали в качестве реаген-
та R1q, после размораживания непосредственно перед титрованием
С1q.
_Получение реагента R1 с помощью IgG-стекла.
5 мл охлажденной сыворотки при 4 5о 0 наносили на колонку с
IgG-стеклом (9,5 х 2 см), уравновешенную VBS pH 7,4, содержащим
0,001 М СаСl 42 0, со скоростью 8 мл/ч. Фракции несвязавшегося бел-
ка собирали по 2 мл и определяли остаточную активность С1q и
С1r 42 0s 42 0, фракции с максимальным поглощением при 280 нм объединя-
ли (10мл), диализовали против VBS 52+ 0 в течение ночи, разливали
небольшими аликвотами по пробиркам, замораживали и хранили при
-70 5о 0. Колонку IgG-стекло-С1 использовали в дальнейшем для выде-
ления С1q, C1r и C1s.
1Гемолитические методы определения активности
1компонентов и факторов комплемента
_Определение гемолитической активности компонентов С2 и С4 .. К
0,2 мл стандартизованной суспензии ЕА в VBS 52+ 0 добавляли 0,05 мл
реагента (R4 или R2 в соответствующем разведении) и 0,25 мл
тестируемой пробы. Смесь инкубировали 30 мин при 37 5о 0, добавляли
2,5 мл 0,15 М NaCl и центрифугировали при 1500g в течение 5
мин. Степень гемолиза определяли по А 4412 0, измеренному против
буфера. Кроме того, ставили контроли на спонтанный лизис (0,2
мл ЕА и 0,3 мл буфера), а также контроль на полный лизис эрит-
роцитов (0,2 мл ЕА и 2,8 мл Н 42 0О). Измеренную величину гемолиза
выражали в виде Z (количество эффективных молекул), которую оп-
ределяли по формуле:
Z = ln _К 4П.Л. 5_ 0 К 4R
К 4П.Л. 0- А 4412 0 ,
где К 4R 0 - контроль реагента (буфер вместо тестируемой пробы),
К 4П.Л. 0 - контроль на полный лизис эритроцитов, А 4412 0 - измеренное
значение тестируемой пробы.
_Определение гемолитической активности компонентов С3 .. К 0,2
мл ЕАС14 (приготовление комплекса описано ниже) добавляли 0,05
мл реагента (R3 или R5 в соответствующем разведении), 0,25 мл
тестируемой пробы и смесь инкубировали при 37 5о 0 в течение 30
мин. После инкубации добавляли по 2,5 мл 0,15 М NaCl и центри-
фугировали при 5 мин при 1500g. Степень гемолиза определяли по
поглощению при 412 нм, измеренному против буфера. В качестве
контролей ставили контроль реагента (0,25 мл буфера вместо тес-
тируемой пробы), контроль на спонтанный лизис эритроцитов (0,2
мл ЕАС1 4 и 0,3 буфера) и контроль на полный лизис эритроцитов
(0,2 мл ЕАС1 4 и 2,8 мл Н 42 0О). Измеренные значения гемолиза вы-
Реферат опубликован: 7/04/2005 (69548 прочтено)