Биотехнология, биопрепараты

Страница: 20/26

После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляли 0,1 мл 1%

взвеси отмытых эритроцитов барана, обработанных антителами и

комплементом,центрифугировали в течение 5 минут при 1000

об/мин. После центрифугирования и повторной инкубации при тем-

пературе 37 5о 0С в течение 30 мин. осадок ресуспендировали и подс-

читывали процент розеткообразующих клеток.

Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах, Т-лимфоцитах (в перифе-

рической крови - 60-79% Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.

Т-лимфоциты практически все без исключения связываются с ЭБ,

и в меньшй степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки и

кролика. При 45 5о 0 происходит обратимая утрата рецепторов к ЭБ

Оптимальная температура - 4-18 5о 0С (При 37 5о 0 число розеток снижа-

ется до 20%). /6504/90-?/

_В-лимфоциты ., имеющие FcR и рецепторы к С3-компоненту компле-

мента (CR1), образуют розетки с эритроцитами барана, обработан-

ными антителами к ним и сывороткой мыши (как источника компле-

мента). Также подсчитывается процент РОК по отношению к 100

лимфоцитам ( _В-РОК .).

В крови В-лимфоцитов - 15% (10-25%).

5Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах, Т-лимфоцитах (в перифе-

5рической крови - 60-79% Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.

5Т-лимфоциты практически все без исключения связываются с ЭБ,

5и в меньшей степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки

5и кролика. При 45о происходит обратимая утрата рецепторов к ЭБ

5Оптимальная температура - 4-18оС (При 37о число розеток снижа-

5ется до 20%). /6504/90-?/ 0

5ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

5СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

Определение активности лимфоцитов - реакция БТЛ в ответ на

митоген лаконоса. (функциональный аспект)

Др. функциональные тесты (экспрессия рецепторов к определен-

ным регуляторам и пр.)

2Определение HLA (по В-лимфоцитам 0,

имеющим и I, и II класс антигенов HLA 2)

К суспензии лимфоцитов добавляют в 100 лунках по трафарету

МАТ к определенному HLA. В 6-12 лунках из 100 происходит обра-

зование ИК, которые выявляют последующим добавлением комплемен-

та (ксеногенной сыворотки). Под микроскопом определяют лунки с

разрушенными лимфоцитами. Если лимфоциты целы, то данного АГ у

человека нет.

5[Из фракции лимфоцитов выделяется В-субпопуляция на нейлоно-

5вой вате; срывается с нейлона. HLA определяется по В-лимфоци-

5там, т.к. на них имеется HLA и I, и II классов.] 0

4Из гепариновой крови человека выделяют лимфоциты (аналогично

4методике определения РОК), раскапывают по 1 мкл в примерно 100

4лунок планшетки. В каждую лунку добавляют МАТ (1 мкл) к соот-

4ветствующему АГ и 1 мкл кроличьего комплемента (цельную сыво-

4ротку). 1 час. 37о. Добавляют эозин, формалин. Планшетку ставят

4под микроскоп и определяют лунки с деструктированными лимфоци-

4тами, т.е. с АГ человека. Если в данную лунку добавлялись МАТ к

4А8 и у человека имеется HLA А8, то антитела связываются с лим-

4фоцитом, т.е. образуется ИК, который активирует систему компле-

4мента и МАК разрушает лимфоцит.

3ОЦЕНКА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА

- Подсчет относительного и абсолютного _количества . В-лимфоци-

тов.

- Развитие гуморального _иммунного ответа

-- после иммунизации АГ-ом.

- Определение функциональной _активности . В-клеток:

-- фенотип,

-- поликлональная активация - пролиферация мононуклеарных

клеток в культуре клеток на среде 199 (реакция бласт-

трансформации на митогены: ЛПС, на митогены в СКЛ),

-- антиген-специфическая стимуляция (иммунизация убитыми

вирусными вакцинами, гемоцианином или бактериофагом ФХ

174),

-- продукция иммуноглобулинов в культуре in vitro,

-- оценка _миграционной активности . (с помощью миграция-ин-

гибирующего фактора = МИФ).

- Определение медиаторов гуморального иммунного ответа в

крови и тканях ( _уровень ИЛ-1,2,6,4 .).

- Оценка функциональной _активности Т-регуляторов . (фенотип,

поликлональная активация митогенами, тесты Т-хелперной и

Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ).

- Определение поверхностных иммуноглобулинов различных клас-

сов на В-лимфоцитах (МИФ и др.).

- Общий уровень (нормальные, анамнестические АТ) иммуногло-

булинов ( _Ig М.G,A .);

4-- ракетный электрофорез (ЭФ)

4-- реакция преципитации (РП) по Манчини

4-- РПГА.

-- Уровень специфических АТ

--- определение титра АТ у больного к определенному инфи-

цирующему агенту (прямая и развернутая РА, РСК):

столбнячных, дифтерийных, стафилококковых, коклюшных,

дизентерийных и др. антител.

- Определение морфологиии лимфоцитов (должны быть шерохова-

тыми)

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ /259,2551к/

────────────────────────────────────┬─────────────────────────

Методы │Чувствительность методов

│(выявляемое количество

│антител, г/мл)

────────────────────────────────────┴─────────────────────────

РА (реакция агглютинации) 10 5-6 0-10 5-7

- сальмонелл 10 5-6

- пневмококков 10 5-2

РГА (реакция прямой гемагглютинации) 10 5-4

РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) 10 5-7 0- 10 5-9

- Реакция Кумбса 10 5-7

Реакция коагглютинации (РКОА) 10 5-8 0-10 5-9

РП (реакция преципитации)

- в геле 10 5-2 0-10 5-3

- кольцепреципитация 10 5-3

- нефелометрия, турбидиметрия

- колориметрия (с реактивом Фолина)

- встречный иммуноэлектрофорез /ИЭФ/ 10 5-6 0-10 5-7

Реакция иммунофлюоресценции (ИФМ) 10 5-7

РЭМА 10 5-9 0и менее

РИМ 10 5-9 0и менее

Иммуноблоттинг (вестерн-блот) 10 5-7 0-10 5-9

РСК (реакция связывания комплемента) 10 5-6

Реакция иммунного лизиса 10 5-8 0-10 5-9

РН (реакция нейтрализации) 10 5-4 0-10 5-6

Реакции анафилаксии, кожная проба

нейтрализации токсина (in vivo)

──────────────────────────────────────────────────────────────

4Выявлена негативная корреляция между Ig M и альфа-2-макрог-

4лобулином (r=-0,85) и максимальная позитивная корреляция

4(r=0,87) между Ig M и , бета-2-гликопротеином и C3а-активатором

4и церулоплазмином. Максимальному уровню Ig G соответствовали и

4максимальные уровни других белков (комплемента, С1-инактивато-

4ра,альфа-1-антитрипсина, альфа-2-макроглобулина и пр.), что да-

4ло основание предположить наличие конституционных типов орга-

4низма по белково-синтетической функции.

2Способы получения антител

2I. Иммунизация (in vivo)

Иммунизация человека или животных с последующим получением

- цельной сыворотки

- гипериммунной сыворотки

- гамма-фракции (гамма-глобулинов)

Используют по жизненным показаниям.

Недостатки антисывороток:

Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и ни

концентрировали, содержит набор различных антител. Поэтому ее

называют поликлональной. Лишь небольшая часть антител направле-

на против специфичных антигенных детерминант, а остальные реа-

гируют с самыми разными антигенами. Этим объясняются многочис-

ленные "перекрестные" положительные реакции, которые приводят к

ошибочным диагнозам.

Еще один серьезный недостаток: для получения антител каждый

раз необходимо заново иммунизировать животных и очищать выде-

ленную сыворотку. Это стоит немалых денег.

3Этапы получения антисывороток

31. Иммунизация

Один объем антигена смешивают с 3 объемами полного адъюванта

Фрейнда и тщательно перемешивают. Полученную эмульсию вводят

внутрикожно по 0,1мл в 10 точек спины, расположенных по 5 в ряд

на расстоянии 2 см по обе стороны от позвоночника. Общая доза

иммуногена равна 10-100 мкг на кролика. Иммунизируют 6 кроликов

массой по 2 кг. Через 8-10 недель проводят пробное кровопуска-

ние. При удовлетворительном качестве антисыворотки последова-

тельно проводят до 3 кровопусканий, после чего кроликам дают от-

дохнуть в течение 1 месяца и затем делают следующие кровопуска-

ния. При неудовлетворительном качестве антисыворотки проводят

Реферат опубликован: 7/04/2005 (69403 прочтено)