Страница: 3/26
тые пробирки, после ее свертывания откручивают на центрифуге,
получается т.н. антисыворотка, из которой можно выделить гам-
ма-глобулиновую фракцию.
Противоэнцефалитный иммуноглобулин получали из сывороток лю-
дей, проживающих в местах распространения данного заболевания,
содержащих достаточно высокий уровень специфических противови-
русных антител. /1430к/
32. 2О 3чистка 0 ( 3фракционирование 0) и тестирование
- Осаждение
-- высаливанием (осаждение сульфатом натрия или сульфатом
аммония)
-- осаждение спиртом
-- полиэтиленгликолем (ПЭГ)
-- каприловой кислотой
- ферментирование
- диализ
- адсорбция
-- аффинной хроматографией
-- выделение на белок А-сефарозе (FcR золотистого стафило-
кокка)
Силу антитоксических сывороток измеряют в международных еди-
ницах (МЕ) по способности нейтрализовать определенную дозу ток-
сина.
_Антисыворотки
- Лечебные │ (используется только по
- Профилактические │ жизненным показаниям)
- Диагностические
По специфичности различают
- моновалентную антисыворотку
- поливалентную антисыворотку
- антицельную антисыворотку (против всех сывороточных белков -
36)
_Недостатки антисывороток .:
- Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и
ни концентрировали, содержит набор различных антител. Поэтому
ее называют поликлональной. Лишь _небольшая часть антител . нап-
равлена _против специфичных антигенных детерминант ..
- Иммуноглобулины антисывороток уже с открытыми углеводными
компонентами, поэтому _быстрее выводятся из организма ..
- Углеводные компоненты, переплетаясь между собой, приводят
к спонтанной _агрегации белков . при длительном хранении, что спо-
собствует в кровотоке закупорке некоторого количества капилля-
ров и активации системы комплемента по альтернативному пути.
- " _Примесные АТ ." дают многочисленные "перекрестные" положи-
тельные реакции, которые приводят к ошибочным диагнозам по се-
родиагностике.
- " _Примесные АГ .". Иные белки сыворотки могут содержать раст-
воримые (сброшенные) антигены HLA, АВ, Rh, иные аллотипы анти-
тел и др., что иммунизирует реципиента.
- Ксеногенные (лошадиные) сыворотки при повторном введении в
организм могут вызывать _аллергические реакции . на чужеродный бе-
лок. Поэтому необходима постановка _внутрикожной пробы . с сыво-
роткой в разведении 1:100 в объеме 0,1 мл. Введение антитокси-
ческой лошадиной сыворотки допустимо лишь в случае отсутствия
выраженной кожной реакции в течение 20-30 минут. /1430к/
- Еще один серьезный недостаток: для получения антител каж-
дый раз необходимо _заново иммунизировать . животных и очищать вы-
деленную сыворотку. Это стоит немалых денег.
_Гамма-глобулины (преимущественно Ig G)
Содержание антител в препаратах иммуноглобулинов человека:
- АТ к токсинам (дифтерийному, столбнячному, пертуссигену)
- Титры агглютинирующих АТ к штаммам возбудителей располага-
ются в следующем порядке (по убыванию)
-- P. aeruqinosa
-- S. sanguis,
-- B. melaninogenicus,
-- B. bronchisrptica,
-- Veillonella,
-- E. coli.
Титры к E.c. очень низкие. /2384к/84/
Использование иммуноглобулинов
для пассивной иммунизации /7330/87/
────────────────────┬─────────────────────┬────────────────────
Пулированные │ Специфические │ Специфические
Ig человека │ Ig человека │ лошадиные Ig
────────────────────┴─────────────────────┴────────────────────
Гуморальный ИД Гепатит В Ботулинум токсин
Гепатит А Бешенство Дифтерийный токсин
Корь Столбняк Змеиный яд
Ветряная оспа Яд паука
Натуральная оспа Black widow
(коровья оспа)
Rh изоиммунизация
pertussis
───────────────────────────────────────────────────────────────
2МАТ
2МАТ (моноклональные антитела) 0 - АТ, полученные из одного
клона культуры плазматических клеток.
МАТ с запрограммированной специфичностью впервые получили
аргентинец Ц.Мильштейн (C.Milstein) и мюнхенец Г.Келер (G.Koh-
ler) /Nature. - 1975. - V.256. - P.495-497/, за что в 1978 году
им была присвоена Нобелевскую премию. Они рассчитывали исполь-
зовать гибридомы лишь для изучения генетики антител, а резуль-
тат привел к подлинному буму.
К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, нес-
колько тысяч гибридом, в т.ч. на 600 вирусных антигенов.
_Получение
1а) В-лимфоциты + вирус Эпстайна-Барра --- клетки быстро пе-
1рестают синтезировать АТ --- формируются опухолемые лимфомные
1клетки
1б) В-лимфоциты селезенки иммунизированной АГ-ом мыши + мие-
1ломная лимфоцитарная клетка + ПЭГ (полиэтиленгликоль) --- слия-
1ние клеток (одной на миллион) --- далее размножается лишь гибрид
1- гибридома (неограниченное размножение).
В основу метода положен давно известный принцип гибридизации
(слияния) соматических (неполовых) клеток с последующим выделе-
нием и культивированием необходимого гибридного клона. Для сли-
яния используют клетки двух видов. Первые - плазмоцитомы (опу-
холевые плазмоциты) из линий, культивируемых в искусственных
условиях, in vitro. Как и все злокачественные клетки они интен-
сивно размножаются без всякого внешнего стимула. Другие клетки
- иммунные лимфоциты. Они несут в себе способность синтезиро-
вать и выделять необходимые антитела. Однако в пробирке эти
клетки существуют лишь несколько дней.
Образовавшийся при слиянии двух клеток гибрид наследует
признаки обоих "родителей".
3Получение гибридом включает 6 основных этапов.
1. Иммунизация, многократное введение мышам или крысам анти-
гена, против которого необходимо получать антитела.
2. Слияние иммунных лимфоцитов селезенки животного с его же
опухолевыми клетками. Для соединения клеток используют обычно
полиэтиленгликоль, разрушающий поверхностные мембраны и спо-
собствующий соединению клеток.
3. Отбор гибридов. Клетки культивируют в среде, содержащей
гипоксантин. Плазмоциты погибают из-за отсутствия фермента, его
разрушающего, а лимфоциты - просто потому, что не умеют долго
поддерживать свое существование вне организма.
4. Скрининг, то есть отбор тех гибридных клеток, которые вы-
рабатывают 3 0антитела против антигена, использованнного для имму-
низации. Антиген прикрепляют к какому-либо носителю, например,
к пластиковым шарикам или пленке. Такой иммобилизованный анти-
ген обрабатывают культуральной жидкостью, в которой растут гиб-
ридомы, а затем наносят меченые антитела против мышиных или
крысиных гибридомных антител (их метят радиоактивными, флуорес-
центными или ферментными метками). Иными 3 0словами, проводят ана-
лиз культуральной жидкости на присутствие антител к искомому
антигену. Если гибридомы производят антитела, то они осядут на
антигене, а к тем, в свою очередь, прикрепятся меченые антите-
ла. В результате метка соединится с антигеном на носителе и за-
фиксируется.
5. Клонирование. Для этой цели несколько гибридных клеток
переносят на питательную среду таким образом, чтобы они росли
на достаточном расстоянии друг от друга. Через несколько дней
вокруг каждой образуется колония дочерних клеток. Это и есть
гибридома. Клетки колонии снова разводят и помещают на пита-
тельную среду, чтобы устроить новые колонии. Клонирование пов-
торяют 3-4 раза, после чего получается устойчивая и продуктив-
ная линия клеток.
6. Повторный скрининг и получение специфических моноклональ-
ных антител. Эти антитела можно выделить из питательной среды в
искусственных условиях или непосредственно из животных, приви-
тых гибридомными клетками (как и многие злокачественные опухо-
ли, гибридому можно прививать).
_Недостатки МАТ:
1. Одна из проблем, связана с тем, что МАТ - продукты _мыши-
_ных . гибридом. В настоящее время разрабатываются способы получе-
Реферат опубликован: 7/04/2005 (69550 прочтено)