Страница: 19/26
- митогены микробного происхождения │
- ЛПС Г- бактерий │ - │ +
- туберкулин │ - /?/ │ + /2551к/98/
- митогены животного происхождения │
- анти-Ig │ - │ +
- смешанная культура │
лимфоцитов (СКЛ) │ - │ + (АПК на HLA)
- митогены растительного происхождения (лектины)
- ФГА │ +(для Тs) │ -
- Кон А │ +(для Тs) │ -
_- митоген лаконоса .│ _ + .│ _ +
5- джекалин 0│ 5 + 0│ 5 связывает Ig A
│ │ 5(используется для
│ │ 5выделения В-клеток
│ │ 5на колонке)
Связывание лектина │ │
Helix pomatia │ + │ -
│ │
Чувствительность │ │
к кортикостероидам │Высокая │Низкая (Л 496 0)
│ │
Функции 1.Участие в реакциях│1.АТ--образование
│ клеточного типа │2.Регуляция ИО
│ (Тк) │ (В-лимфоциты- АПК
2.Иммунорегуляторная│ = АГ-презентирую-
│ (Тх, Тs) │ щие клетки)
──────────────────────┴───────────────────┴────────────────────
3а. Д-лимфоциты - двойные лимфоциты, несущие на своей по-
верхности маркеры Т- и В-лимфоцитов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ
(количественный аспект; без разделения)
5I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ
5МЕТОДОМ МЕМБРАНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ /метод МИФ/
Анализ поверхностных маркеров субпопуляций лимфоцитов,
(хелперы, супрессоры, эффекторы).
1ЕКК (CD3- _CD56+ .),
В-клетки (СD19+)
Т-лимфоциты ( _ 2СD3+ . 0,CD56-) 1 - Образует комплекс с рецептором для АГ.
Тх - CD4+
Ts,Tk - CD8+.
Выделение лимфоцитов на фиколе --- мазок --- высушивание ---
фиксация --- обработка МАТ к определенному АГ --- обработка ан-
тисывороткой к МАТ (к Fc-фрагменту), меченых флюорохромом ---
микроскопия под люминисцентным микроскопом.
(Или в пробирке смешать суспензию лимфоцитов с МАТ --- мазок)
_Определение субпопуляции лимфоцитов с помощью МАТ
(моноклональных антител) методом непрямой поверхностной
иммунофлуоресценции
Для постановки этой реакции в центрифужную стеклянную пробир-
ку вносят 500 тысяч лимфоцитов, выделенных в градиенте фи-
колл-верографин. К 30 мкл суспензии клеток добавляют 20 мкл го-
тового коммерческого раствора МАТ, осторожно перемешивали и ин-
кубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. После
инкубации к лимфоцитам добавляли 1 мл раствора Хенкса, перемеши-
вали легким покачиванием пробирки и центрифугировали 2 - 3 мину-
ты при 1200 об./мин. Надосадочную жидкость осторожно сливали, а
оставшиеся капли среды убирали фильтровальными полосками.
В пробирку к отмытым клеткам вносят 20 мкл вторых (антимыши-
ных) антител, меченных ФИТЦ (FITC anti Mi), нежно перемешивают и
помещают в рефрижератор при 4 5о 0С на 30 минут. После реакции лим-
фоциты дважды отмывают раствором Хенкса и к осадку клеток добав-
ляют 50 мкл того же раствора, клетки ресуспендируют легким пока-
чиванием пробирки. Суспензию клеток переносят в лунки парафилма
на сухое предметное стекло, предварительно обработанное в 0,005%
растворе poly-L-lysine (Sigma), и инкубируют там в течение 20
мин при комнатной температуре. После адгезии клеток к стеклу ос-
торожно полосками фильтровальной бумаги убирали среду и вносили
по 20 мкл 50%-го раствора глицерина. При люминесцентной микрос-
копии использовали объектив микроскопа х90, окуляр х10. Оценку
реакции осуществляли по проценту светящихся клеток.
Характеристика моноклональных антител
в реакции непрямой поверхностной иммунофлуоресценции
──────────────┬ 5──────┬──────┬─────────────── 0┬──────────────────
Моноклональное│ 5Изотип│ Клон│ Молекулярная 0│ Специфичность
антитело │ 5 │ │ масса антигена 0│
──────────────┼ 5──────┼──────┼─────────────── 0┼───────────────────
DT-Anti-CD 3 │ 5IgG 2a│ICO 90│ 26,20,16 кДа 0│Зрелые Т-лимфоциты
│ 5 │ │ 0│
DT-Anti-CD 4 │ 5IgG 1 │ICO 86│ 56 кДа 0│Зрелые Т-хелперы/
│ 5 │ │ 0│ индукторы
│ 5 │ │ 0│
DT-Anti-CD 8 │ 5IgG 1 │ICO 31│ 32 кДа 0│Супрессорные/ цито-
│ 5 │ │ 0│токсические (киллер-
│ 5 │ │ 0│ные) лимфоциты
│ 5 │ │ 0│
DT-Anti-CD 16 │ 5IgG 1 │ICO116│ 50-65 кДа 0│NK-клетки, грануло-
│ 5 │ │ 0│лоциты, макрофаги
│ 5 │ │ 0│
DT-Anti-CD 22 │ 5IgG M │ICO 91│ 140 кДа 0│ В-лимфоциты
│ 5 │ │ 0│
──────────────┴ 5──────┴──────┴─────────────── 0┴─────────────────────
5II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА
5СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК
Подсчитать относительное количество Т- и В-лифоцитов в гото-
вых мазках. Сделать заключение о наличии иммунодефицита.
5ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК
В крови - 60-80% Е-РОК,
в лимфе - 95%,
в ЛУ - 65-70%,
в селезенке - 35-40%,
в тимусе - более 95%.
Данный тест - мера количества, а не функциональной активнос-
ти клеток. /6504/90-?/
CD2 - рецептор для эритроцитов барана. При смешивании сус-
пензии лимфоцитов с эритроцитами барана последние приливают к
ним, образуя т.н. "розетку". Процент розеток с эритроцитами ба-
рана /ЭБ/ по отношению к общему количеству лимфоцитов, оценива-
емое при проведении микроскопии, отражает относительное число
_Т-лимфоцитов (Т-РОК . = Т-розеткообразующая клетка).
- Теофиллин-резистентные Е-РОК (Тх) - 50-63%.
- Теофиллин-чувствительные Е-РОК (Тs) - 17-20%.
Количество Т-лимфоцитов (Е-РОК)
- в крови - 60 (80)%,
- в лимфе - 95%,
- в ЛУ - 65-70%,
- в селезенке - 35-40%,
- в тимусе - более 95%.
┌───┐ ┌───┐
CD2 4─ 0┤ 6 0Т 6 0├ 4─ 0CD2 FcR 4─ 0┤ 6 0В 6 0├ 4─ 0СR1
└───┘ └───┘
_Определение Т-лимфоцитов . осуществляли с помощью розеткообра-
зования с эритроцитами барана (Е-РОК). С этой целью лимфоциты
человека, взвешенные в среде 199, в концентрации 2 х 10 56 0 в 1 мл
предварительно инкубировали с исследуемыми образцами полипепти-
дов в различной конечной концентрации при температуре 37С в те-
чение 1 часа. После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добав-
ляли 0,1 мл 1% взвеси отмытых эритроцитов барана, центрифугиро-
вали в течение 5 минут при 1000 об/мин. После центрифугирования
осадок ресуспендировали и подсчитывали процент "активного" ро-
зеткообразования Т-лимфоцитов с эритроцитами барана. Для опре-
деления общего числа Т-лимфоцитов лимфоцитарно-эритроцитарную
взвесь оставляли при температуре 4 5о 0С в течение 2-х часов, после
чего подсчитывали в камере Горяева процент розеткообразующих
клеток.
- Теофиллин-резистентные Е-РОК (Тх) - 50-63%.
- Теофиллин-чувствительные Е-РОК (Тs) - 17-20%.
_Определение В-лимфоцитов . осуществляли с помощью розетко-
образования с эритроцитами барана, обработанными антителами и
комплементом. В этом случае также лимфоциты человека, взвешен-
ные в среде 199, в концентрации 2 х 10 56 0 в 1 мл предварительно
инкубировали с исследуемыми образцами полипептидов в различной
конечной концентрации при температуре 37 5о 0С в течение 1 часа.
Реферат опубликован: 7/04/2005 (69568 прочтено)